如何清除细菌污染-迪医明生物

1.细菌污染的特征

细菌污染是细胞培养中最常见的污染，其污染主要来源于实验室环境、实验人员、实验服、实验耗材、共用试剂等，甚至在细胞培养过程中添加双抗，也经常因为操作不慎而引起污染。

很多实验人员容易将细菌和“黑胶虫”区分不清，极易造成污染种类判断错误而“延误病情”，“黑胶虫”是一种常见的细胞污染物，与细胞竞争性生长，对细胞生长不利，严重时导致细胞死亡。目前很多细胞存在被“黑胶虫”污染的现象，对细胞培养及其后续实验造成了极大地影响。

“黑胶虫”污染与细菌污染最明显的一个差别就是：“黑胶虫”污染的培养基不浑浊，在显微镜下观察，细胞周围和培养液中有“黑胶虫”呈现布朗运动。细菌污染在1~2后会出现浑浊、PH下降变黄，污染初期培养基肉眼观察无明显改变，只有在倒置显微镜下仔细观察才能发现在培养基内“一穿而过”的细菌，所以需要实验员每天细心观察才能及时发现细菌污染，一般细菌污染进程很快，有的细胞在培养箱过夜后肉眼就能显著观察到浑浊，在显微镜下可以观察到黑点在培养基内游动，细胞变圆或者崩溃，从壁上脱落死亡。

细菌污染爆发图片

2.清除细菌污染操作规程

从-20℃冰箱内取出细菌清除剂，将试剂管瞬时离心（3000rpm，3~5s）后放置于EP管架上，用75%的酒精喷洒试剂管的表面，在生物安全柜中进行无菌操作；

以T25细胞培养瓶为例

对于培养基中有偶有黑点穿过但未见明显浑浊的细胞，处于细菌污染初期，需要立即更换为含有细菌清除剂的完全培养基，通常推荐使用的稀释倍数为2000×，如：6mL的完全培养基加入3μL的细菌清除剂混匀，连续加药培养1~2周即可有效清除细菌污染。

对于培养基突然变黄并明显沙化浑浊的细胞，此时细菌污染已非常严重，需要酌情增加药物浓度以提高清除细菌的效率，建议提高至1000×浓度进行清除，如：6mL的完全培养基加入6μL的细菌清除剂混匀。每天换液两次，建议上午进入实验室进行一次加药培养基换液，下午离开实验室之前进行一次加药培养基换液，第二天和第三天重复此过程，第四天开始即可每天换液一次，连续加药培养1~2周（或传代3次）后，无菌检测判断是否还存在细菌污染。

注意：

① 贴壁细胞换液或传代前，弃去旧的培养基，用PBS轻轻冲洗细胞表面2次。

② 若细胞达到可传代比例，请及时传代并铺入新的细胞培养瓶，换新瓶的过程也可有效规避培养瓶壁上残留细菌的污染；

③ 细菌清除干净后，必须进行传代并铺入新的细胞培养瓶，且在新瓶中加药维持1~2天后，才可以撤掉细菌清除剂，避免在旧瓶中撤药后旧瓶壁上的细菌残留造成二次污染；

④ 由于胚胎干细胞（H1、H9、iPS）非常“脆弱”，若污染严重，建议采用2000×浓度清除细菌。

3.预防细菌污染操作规程

若细胞需连续培养，培养存在共用实验仪器、耗材、试剂或实验室曾经出现过大规模的细菌污染，建议每2~3周进行定期预防。在细胞培养基中加入适量细菌清除剂，通常推荐使用的稀释倍数为3000×，如：6mL的细胞培养基加入2μL的细菌清除剂混匀。连续加药培养1周后即可有效防止细菌污染或抑制细菌增殖。

4.实验流程图

细菌清除流程图

5. 特别提醒

① 为了发挥最好的药效，含药培养基建议现配现用，如果加药培养基未用完，于4℃冰箱中避光保存，2周内用完，使用培养基前需预热至37℃；

② 如遇个别细胞对本试剂敏感，细胞生长速度明显受影响时，建议减量使用或进行稀释度测试；

③ 细菌清除剂处理后，会有很好的预防和清除效果，但是如果环境、耗材、试剂中仍有污染源存在，细胞可能会再次污染，因此需做好适当的预防措施；

6.清除案例

对照组（未加药处理）

实验组（加药处理）

加“细菌清除剂”实验组与对照组对比图