细菌16S rRNA基因测序平台比较

1.细菌16SrRNA基因测序平台介绍

1.1 Roche454 测序平台

罗氏454测序系统是454生命科学公司推出的454测序技术，是基于焦磷酸测序法的高通量测序系统，开创了第二代测序技术的先河。该技术是通过合成反应而测序(Seqencing-by-synthesis,SBS)的原理进行测序的。

原理：GSFLX(+) 系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GSFLX(+)系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。

此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。

温馨提示：罗氏宣布2016年逐步关闭454测序业务~！

Roche 454测序仪示意图

1.2 illumina Hiseq 2500等测序平台

Illumina Hiseq系列测序仪器包含Hiseq2000/2500/3000/4000、X-(five)ten、Nova Seq、MiniSeq等。但由于测序最大读长的限制，仅有Hiseq2500快速测序模式可以应用在细菌16SrRNA基因测序领域中，最大读长可以达到2×250bp；近日，Illumina推出新款试剂可以使得NovaSeq平台运行读长达到2×250bp。

原理：Solexa是一种基于边合成边测序技术（Sequencing-By-Synthesis，SBS）的新型测序技术。通过单分子阵列实现在小型芯片（FlowCell）上进行桥式PCR反应。通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用相应的激光激发荧光集团，捕获激发光，从而读取碱基信息。

Hiseq测序仪示意图

1.3 illumina Miseq测序平台

快速简约，适合靶向和小型基因组测序。

MiSeq桌上型测序仪能实现更专门的应用。比如靶向基因测序、宏基因组测序、小型基因组测序、靶向基因表达、扩增子测序，以及HLA分型。

Miseq测序仪示意图

1.4 Ion torrent测序平台（二代半测序，ion S5[XL、Prime、GeneStudio]等）

Ion Torrent 测序仪是第一个不需要光学系统的商业测序仪，所采用的技术为半导体测序，通过半导体芯片直接将化学信号转换为数字信号。一种非常适合扩增子测序的革命性技术。

原理：使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链，随后依次掺入ACGT。随着每个碱基的掺入，释放出氢离子，在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H+ 的检测，实时判读碱基。

Ion S5系列测序仪示意图

1.5 PicBio Sequal/RS II测序平台(三代测序)

Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（SingleMolecule Real Time, SMRT）。

原理：PacBioSMRT技术应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体，芯片上有很多小孔，每个孔中均有DNA聚合酶。测序DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。

Pcibio测序仪示意图

2. 测序平台间比较​

测序平台比较汇总表

备注：

数据量：1G=1000M；1M=1000Kb；1Kb=1000bp。

3. 测序平台的选择

3.1 选择测序平台考虑的因素

①欲研究的目标区域；

②确定目标区域的长度；

③根据读长限制和成本等综合考虑选择合适测序平台。

3.2 如何判断目标区域长度是否适合测序平台

双端测序需要考虑到拼接的问题，因此目标区域长度应该短于测序仪器的读长，~小于50bp。例如：Miseq2×300bp。

PE测序示意图

备注：Read2 & Read3测的是标签序列（index序列），主要用于区分Read1 & Read4隶属于哪个样本。

4. 选择测序服务商时应注意的问题

①研究16S rRNA基因的可变区是哪个或哪几个？

②采用的引物名称是什么？

③测序时采用什么测序平台？

④测序平台是否与扩增目标区域长度匹配？