EcDNA和表观再次神结合,发现ecDNA在癌细胞内“团伙作案”

文献:EcDNAhubs drive cooperative intermolecular oncogene expression

自从2019年11月末,吴思涵在Nature上发表关于ecDNA促进原癌基因表达的文章,瞬间ecDNA成为了科研圈和精准医疗行业的焦点。
虽然,ecDNA在人类癌症细胞中广泛存在,已知它通过增加拷贝数和改变基因调控方式介导癌基因的高表达,但是具体的分子作用机制未知。

近期,美国斯坦福大学Howard Y. Chang研究团队,预印发表在 bioRxiv 上了一篇题为“EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression”的文章,发现癌细胞中携带癌基因的ecDNA 不是单独发挥作用,而是聚集成簇(ecDNA hubs)促进了增强子-启动子相互作用和癌基因表达,在致癌基因的表达中发挥重要的作用。文章提出,ecDNA hubs可以作为癌症治疗新靶点。

研究背景

此前的研究发现,大量的癌基因会从染色体上脱落下来,以环状的形式存在于肿瘤细胞内,这就是Extrachromosomal DNAs,即 ecDNA
EcDNAs是一种共价闭合、双链DNA,大小约100kb至几MB,缺乏中心粒,在细胞中随机分布,受到药物或者其他适应性环境的影响。
而且,EcDNA在细胞中是进化的,可以重新整合进染色体或者形成重复序列HSR。EcDNA还可以增加染色体的开放性和松散程度。

MYC是较早发现的癌基因,定位于8号染色体上,是重排热点,30%的MYC在ecDNA上扩增。

PVT1是一个长链非编码RNA基因,位于8q24区域,在基因座扩增时导致染色体片段内或者染色体区段间的基因重排,产生新的融合基因。

PVT1MYC形成新的融合基因PVT1-MYC,是最常见的基因重排。本研究中,通过检测在MYC-PVT1融合基因的ecDNA空间、表观和转录水平的动态变化发现,ecDNA hubs作为一个组合的增强子集合体,对致癌基因的转录发挥调控

研究结果

1. EcDNA hubs是致癌基因转录的主要位点

首先,分别在前列腺癌(PC3)、结直肠癌(COLO320-DM)、胶质母细胞瘤(HK359)以及胃癌(SNU16)采用FISH方法检测ecDNA在细胞核内的位置,发现这些ecDNA是几十到几百个聚集在一起且这种聚集是动态变化的,会随着时间而移动,形态也会发生改变。

结合DNA和新生RNA的FISH检测PC3和COLO320-DM细胞中ecDNA hubs中MYC位点的转录活性,发现ecDNA hubs上致癌基因转录活性高于染色体位点,且MYC的转录活性与ecDNA的聚集显著相关。

2. 单细胞水平上鉴定与致癌基因表达相关的ecDNA增强子

为了了解ecDNA上致癌基因的表达调控机制,鉴定了ecDNA上的调控元件,并且检测细胞间的ecDNA异质性,去鉴定调控元件在ecDNA上致癌基因的表达。

采用单细胞组学的方法,在同一个细胞中进行RNA-seq和ATAC-seq,共检测到72049细胞,包括COLO320-DM和COLO320-HSR。

进一步进行联合分析染色质的开放性与基因表达共变化,发现ecDNA存在高度异质性,COLO320-DM中MYC的染色质开放性。MYC高表达的细胞中包含有更高的ecDNA拷贝数,也有更多的可接近元件。差异peak分析在MYC 高表达的细胞中鉴定到了47个元件,而HSR上只有5个。

3. 增强子和启动子分子间相互作用促进了ecDNA的多样性和致癌基因的表达

**采用WGS,单分子DNA测序以及3D增强子的检测,分析ecDNA

hubs对致癌基因表达的调控**。

先根据之前的WGS的数据,检测COLO320-DM细胞中ecDNA,在MYC位点有重排,确定PVT1MYC的外显子2和3发生融合,并采用nanopore三代单分子测序的方法进行了验证,结果显示,EcDNA分子在COLO320-DM中存在高度的异质性

然后采用HiChIP检测H3K27ac与激活型增强子和ecDNA的作用,发现紧密程度与ecDNA的拷贝数密切相关。此外,通过scATACseq鉴定了大量的激活型增强子,与MYC基因有相互作用的。

BET是染色质阅读蛋白,为了检测BET蛋白在ecDNA促进转录作用,检测在两种细胞中MYC位点BRD4的定位情况。

根据H2K27ac,BRD4的ChIPseq结果和ATACseq数据,表明H3K27ac 存在的激活的ecDNA增强子,与BRD4共存。BRD4连接ecDNA hubs,促进致癌基因的转录,ecDNAs和染色体基因扩增在细胞中有两种相反的策略,一种是抑制PVT1的启动子的抑制剂,激活MYC的转录;另一种是相反的,删除PVT1的启动子。

最后,评估BET抑制剂JQ1在ecDNA hubs的功能中作用。

发现加入JQ1后,ecDNA出现分散,且有细胞特异性。而RNA PolII抑制剂,降低MYC的转录,但是不影响ecDNA hubs的聚集。通过新生RNA和DNA FISH BRD4的ChIP-seq这些结果表明,ecDNA hub的形成依赖于BET蛋白,而ecDNA hubs的破坏会引起MYC**致癌基因转录的抑制和ecDNA癌细胞的死亡。

除了BET的抑制剂会抑制ecDNA的转录,我们还发现,CRISPR的干扰剂,也可以抑制PVT1的启动子,降低了PVT1-MYC的转录,和总的MYC的RNA水平。ecDNA可能是一个更有效的方法去调控致癌基因的表达。

4. ecDNA hubs调控两个致癌基因位点的互作

为了研究ecDNA的增强子和启动子之间的相互作用,检测人胃癌SNU16细胞中,包含MYCFGFR2的两种类型ecDNAs。FISH检测,发现MYCFGFR2的共定位对于致癌基因的表达非常重要。

总之,本文发现,癌细胞中携带有致癌基因的ecDNA是成簇出现的,形成一个 ecDNA hub,促进了新的增强子和启动子的相互作用和致癌基因的表达

反过来,这些增强子导致了细胞间的异质性ecDNA可以调控远距离的基因表达,不像染色体转录因子的hub限定在一定空间的顺式作用元件,为肿瘤治疗提供了新的思路。

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