EcDNA和表观再次神结合，发现ecDNA在癌细胞内“团伙作案”

文献：EcDNAhubs drive cooperative intermolecular oncogene expression

自从2019年11月末，吴思涵在Nature上发表的关于ecDNA促进原癌基因表达的文章，瞬间ecDNA成为了科研圈和精准医疗行业的焦点。
虽然，ecDNA在人类癌症细胞中广泛存在，已知它通过增加拷贝数和改变基因调控方式介导癌基因的高表达，但是具体的分子作用机制未知。

近期，美国斯坦福大学Howard Y. Chang研究团队，预印发表在 bioRxiv 上了一篇题为“EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression”的文章，发现癌细胞中携带癌基因的ecDNA 不是单独发挥作用，而是聚集成簇（ecDNA hubs），促进了增强子-启动子相互作用和癌基因表达，在致癌基因的表达中发挥重要的作用。文章提出，ecDNA hubs可以作为癌症治疗新靶点。

研究背景

此前的研究发现，大量的癌基因会从染色体上脱落下来，以环状的形式存在于肿瘤细胞内，这就是Extrachromosomal DNAs，即 ecDNA。
EcDNAs是一种共价闭合、双链DNA，大小约100kb至几MB，缺乏中心粒，在细胞中随机分布，受到药物或者其他适应性环境的影响。
而且，EcDNA在细胞中是进化的，可以重新整合进染色体或者形成重复序列HSR。EcDNA还可以增加染色体的开放性和松散程度。

MYC是较早发现的癌基因，定位于8号染色体上，是重排热点，30%的MYC在ecDNA上扩增。

PVT1是一个长链非编码RNA基因，位于8q24区域，在基因座扩增时导致染色体片段内或者染色体区段间的基因重排，产生新的融合基因。

PVT1与MYC形成新的融合基因PVT1-MYC，是最常见的基因重排。本研究中，通过检测在MYC-PVT1融合基因的ecDNA空间、表观和转录水平的动态变化发现，ecDNA hubs作为一个组合的增强子集合体，对致癌基因的转录发挥调控。

研究结果

1. EcDNA hubs是致癌基因转录的主要位点

首先，分别在前列腺癌（PC3）、结直肠癌（COLO320-DM）、胶质母细胞瘤（HK359）以及胃癌（SNU16）采用FISH方法检测ecDNA在细胞核内的位置，发现这些ecDNA是几十到几百个聚集在一起且这种聚集是动态变化的，会随着时间而移动，形态也会发生改变。

结合DNA和新生RNA的FISH检测PC3和COLO320-DM细胞中ecDNA hubs中MYC位点的转录活性，发现ecDNA hubs上致癌基因转录活性高于染色体位点，且MYC的转录活性与ecDNA的聚集显著相关。

2. 单细胞水平上鉴定与致癌基因表达相关的ecDNA增强子

为了了解ecDNA上致癌基因的表达调控机制，鉴定了ecDNA上的调控元件，并且检测细胞间的ecDNA异质性，去鉴定调控元件在ecDNA上致癌基因的表达。

采用单细胞组学的方法，在同一个细胞中进行RNA-seq和ATAC-seq，共检测到72049细胞，包括COLO320-DM和COLO320-HSR。

进一步进行联合分析染色质的开放性与基因表达共变化，发现ecDNA存在高度异质性，COLO320-DM中MYC的染色质开放性。MYC高表达的细胞中包含有更高的ecDNA拷贝数，也有更多的可接近元件。差异peak分析在MYC 高表达的细胞中鉴定到了47个元件，而HSR上只有5个。

3. 增强子和启动子分子间相互作用促进了ecDNA的多样性和致癌基因的表达

**采用WGS，单分子DNA测序以及3D增强子的检测，分析ecDNA

hubs对致癌基因表达的调控**。

先根据之前的WGS的数据，检测COLO320-DM细胞中ecDNA，在MYC位点有重排，确定PVT1和MYC的外显子2和3发生融合，并采用nanopore三代单分子测序的方法进行了验证，结果显示，EcDNA分子在COLO320-DM中存在高度的异质性。

然后采用HiChIP检测H3K27ac与激活型增强子和ecDNA的作用，发现紧密程度与ecDNA的拷贝数密切相关。此外，通过scATACseq鉴定了大量的激活型增强子，与MYC基因有相互作用的。

BET是染色质阅读蛋白，为了检测BET蛋白在ecDNA促进转录作用，检测在两种细胞中MYC位点BRD4的定位情况。

根据H2K27ac，BRD4的ChIPseq结果和ATACseq数据，表明H3K27ac 存在的激活的ecDNA增强子，与BRD4共存。BRD4连接ecDNA hubs，促进致癌基因的转录，ecDNAs和染色体基因扩增在细胞中有两种相反的策略，一种是抑制PVT1的启动子的抑制剂，激活MYC的转录；另一种是相反的，删除PVT1的启动子。

最后，评估BET抑制剂JQ1在ecDNA hubs的功能中作用。

发现加入JQ1后，ecDNA出现分散，且有细胞特异性。而RNA PolII抑制剂，降低MYC的转录，但是不影响ecDNA hubs的聚集。通过新生RNA和DNA FISH BRD4的ChIP-seq这些结果表明，ecDNA hub的形成依赖于BET蛋白，而ecDNA hubs的破坏会引起MYC**致癌基因转录的抑制和ecDNA癌细胞的死亡。

除了BET的抑制剂会抑制ecDNA的转录，我们还发现，CRISPR的干扰剂，也可以抑制PVT1的启动子，降低了PVT1-MYC的转录，和总的MYC的RNA水平。ecDNA可能是一个更有效的方法去调控致癌基因的表达。

4. ecDNA hubs调控两个致癌基因位点的互作

为了研究ecDNA的增强子和启动子之间的相互作用，检测人胃癌SNU16细胞中，包含MYC和FGFR2的两种类型ecDNAs。FISH检测，发现MYC和FGFR2的共定位对于致癌基因的表达非常重要。

总之，本文发现，癌细胞中携带有致癌基因的ecDNA是成簇出现的，形成一个 ecDNA hub，促进了新的增强子和启动子的相互作用和致癌基因的表达。

反过来，这些增强子导致了细胞间的异质性。ecDNA可以调控远距离的基因表达，不像染色体转录因子的hub限定在一定空间的顺式作用元件，为肿瘤治疗提供了新的思路。