RBP AS生信流程（三）定量

RSEM软件

##step1 准备参考文件：共三个参数：
rsem-prepare-reference --gtf gtf文件 \
参考基因组文件 \
位置/命名
##step2 定量计算
rsem-calculate-expression \
--paired-end \ （双端测序）
--no-bam-output \ （只定量计算，不输出bam文件结果）
--alignments \ (输入文件本身就是STAR比对输出的结果，这个参数代表输入文件是比对好的bam，不是原始fastq文件)
-p 15 \ （线程数）
-q 03align_out/sample1_1Aligned.toTranscriptome.out.bam \ （转换为转录本后的bam文件）一定要是转换为转录本后的bam文件
arab_RSEM/arab_rsem \ （索引）
04rsem_out/sample1_1rsem （输出目录/输出文件）

会生成基于基因的定量结果_rsem.gene.results和基于转录本的定量结果_rsem.isoform.results，isoforms.results中包含了转录本ID，基因ID，转录本长度，有效长度，expected_count，TPM，FPKM和IsoPct（该转录本表达量占基因总表达量的百分比）。genes.results中的内容与之类似，只是少了IsoPct

##step3：整合结果，构建表达矩阵
#将n个rsem.genes.results整合到1个矩阵里面
rsem-generate-data-matrix *rsem.genes.results > output_matrix
##step4：删除在所有样本里表达量为0的基因
awk 'BEGIN{printf "geneid\ta1\ta2\tb1\tb2\n"}{if($2+$3+$4+$5>0)print $0}' output_matrix > edgeR_input.txt
#查看删除前后文件的行数
wc -l output_matrix 
wc -l edgeR_input.txt

featurecounts软件

sudo apt install subread#安装 featureCounts是subread软件包中的一种工具
featureCounts --help #可以使用
featureCounts \
-p \ (双端测序) 
-a \ (gtf文件) 
-o \ (输出文件) 
-T \ (线程) 
-t \ 想要统计的feature 的名称， 取值范围是gtf 文件中的第3列的值，默认是exon
-g \ 想要统计的meta-feature 的名称，取值范围参考gtf 第9列注释信息，
     gtf 的第9列为 key=value 的格式， -g 参数可能的取值就是所有的key, 默认值是gene_id
_Aligned.sortedByCoord.out.bam \ bam文件

2020-08-15总结：STAR+featureCounts和STAR+RSEM软件时平行的，前者是基于基因组比对，后者是基于转录本比对，目前用STAR+featureCounts即可。

2020.08.30
在GSE46224文件夹里，对STAR输出的bam文件用featurecounts进行定量

文件夹

对SRR830973-SRR830988进行定量，写脚本：

for i in {830973,830974,830975,830976,830977,830978,830979,830980,830981,830982,830983,830984,830985,830987,830988}
do
    featureCounts -p -a /home/sxw/HF/Homorefer/humangtf/genecode38.gtf -o SRR${i}.counts.txt \
    -T 5 -t exon -g gene_id SRR${i}_Aligned.sortedByCoord.out.bam
done

结果：

FC的结果2

53.7%的比对成功率，可以接受。