利用igraph包可视化基于KNN的单细胞聚类关系

0、背景

(1)在Seurat等包中,在进行挑选高变基因,PCA分析后,多使用SNN(shared nearest neighbor)算法进行单细胞聚类,然后进行TSNE或者UMAP二维可视化。


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(2)在一篇文献中,作者使用另一种思路:利用k-means聚类,然后进行基于KNN(k-nearest neighbor)的可视化。


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下图是我根据文献流程绘制的结果,大致流程为
  • 单细胞表达矩阵质控、过滤;
  • 挑选Top5000高变基因;
  • PCA主成分分析;
  • k-means方法聚类(可进一步对cluster完成细胞类型注释);
  • KNN方法进行可视化;
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KNN-graph是使用igraph包进行绘制,关于igraph包的相关介绍,会在笔记第二大点介绍。

1、具体绘图流程

1.0 原始数据

  • 文献:Predicting bacterial infection outcomes using single cell RNA-sequencing analysis of human immune cells https://doi.org/10.1038/s41467-019-11257-y
  • 测序数据:GSE122083的GSM3454528单细胞表达矩阵


    4

1.1 表达矩阵质控(部分参考文献过滤标准)

  • (1)基因去重,取表达量高的
tmp1 <- read.table("GSM3454528_naive_cells.txt.gz",
                  header = T,#row.names = 1,
                  stringsAsFactors = F)
tmp1 <- tmp1[order(apply(tmp1[,-1], 1, sum),decreasing = T),]
tmp1 <- tmp1[!duplicated(tmp1$genes),]
tmp1 <- tmp1[order(tmp1$genes),]
rownames(tmp1) <- tmp1[,1]
tmp1 <- tmp1[,-1]
  • (2)按照文库因子标准化
lib.size=colSums(tmp1)/median(colSums(tmp1))
tmp1.new=tmp1
for(i in 1:length(lib.size)){
    print(i)
    tmp1.new[,i]=tmp1[,i]/lib.size[i]
}
tmp1=as.matrix(tmp1.new)
  • (3) log转换
tmp1=log2(tmp1+1)
dim(tmp1)
#[1] 18405  3515
#3515个细胞,18405个基因结果

1.2 挑选Top5000高变基因,进行主成分分析

  • 构建Seurat对象,利用FindVariableFeatures()函数处理
library("Seurat")
scRNA = CreateSeuratObject(counts=tmp1)
scRNA <- FindVariableFeatures(scRNA, selection.method = "vst", nfeatures = 5000) 
hvg.gene=VariableFeatures(scRNA)
str(hvg.gene)
#chr [1:5000] "CCL5" "IGKC" "LYZ" "IGLC2" "HLA-DRA" "GNLY" "FTH1" "CD74" ...
  • 得到新的表达矩阵
tmp1.hvg=tmp1[rownames(tmp1) %in% hvg.gene,]
dim(tmp1.hvg)
[1] 5000 3515
  • prcomp()主成分分析
pca <-prcomp(t(tmp1.hvg))
dim(pca$x)
#[1] 3515 3515
pca$x[1:4,1:4]
#                         PC1       PC2        PC3        PC4
#AAACCTGAGCTATGCT.1 3.1894482 -0.829263  3.1659335 -0.1827105
#AAACCTGCACTTCGAA.1 2.7927029  2.527055  0.8481548 -2.9785372
#AAACCTGGTTGGTGGA.1 3.1512823  1.051601  0.7916325  0.1704211
#AAACCTGTCCATGAAC.1 0.7509956 -8.282673 -4.5208889 -0.2187663

1.3 k-means cluster聚类

  • 单细胞聚类分析时一般较少用到k-means方法。因为这种方法需要提前指定聚类数k。
  • 如果使用这种方法,也很简单。根据主成分分析得到的结果,使用kmeans()函数即可。
#这里使用前20个主成分,指定聚类数k=10
clust.kmeans <- kmeans(pca$x[,1:20], centers=10)
table(clust.kmeans$cluster)
#  1   2   3   4   5   6   7   8   9  10
#418  25 148 117 350 577 660 199 361 660

1.4 KNN可视化

  • 主要根据每个细胞的主成分属性,找到与其相距“最近”的X个细胞。再利用igraph包将这些关系可视化,并标准cluster信息
  • 其中主要涉及连个参数。一个是选用主成分数目;一个是相距最近的多少个细胞。
  • 下面代码为采用前50个主成分,以及top20最近细胞进行操作
#得到所有细胞两两间的距离矩阵
dist<-as.matrix(dist(pca$x[,1:20]))
dist[1:3,1:3]
#                   AAACCTGAGCTATGCT.1 AAACCTGCACTTCGAA.1 AACCTGGTTGGTGGA.1
#AAACCTGAGCTATGCT.1           0.000000           6.929171           6.658774
#AAACCTGCACTTCGAA.1           6.929171           0.000000           5.526362
#AAACCTGGTTGGTGGA.1           6.658774           5.526362           0.000000

# 定义具有两列的空矩阵
edges <- mat.or.vec(0,2)

# for循环为每个细胞寻找最近的20个细胞
for (i in 1:nrow(dist)){
    # find closes neighbours(matches即表示最近细胞的编号)
    matches <- setdiff(order(dist[i,],decreasing = F)[1:21],i) #去除细胞自己与自己的距离
    # add edges
    edges <- rbind(edges,cbind(i,matches))  
  }
head(edges, 50)
# 创建igraph对象
library(igraph)
graph <- graph_from_edgelist(edges,directed=F)
graph

如下图,该igraph对象有3515个节点(细胞),70300条边(最近距离关系)


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#颜色标记细胞分类
cols<-rainbow(10)
names(cols) <- unique(clust.kmeans$cluster)
col.clust <- cols[clust.kmeans$cluster]
#由于窗口绘图,所以保存为图片再查看
png("test1.png")
set.seed(1)
plot(graph,vertex.size=1,vertex.label=NA,vertex.frame.color=NA,vertex.color=col.clust,
            edge.width=0.5,main="50PCs; k=20")
legend("topright",names(cols),col=cols,
       pch=16,cex=0.5,bty='n')
dev.off()
image.png

plot会自动调用plot.igraph进行绘制。值得注意的是其中的layout参数默认为layout_nicely,即自动根据节点间关系绘制最适宜的排版,但每次绘图结果会略有差异,可设置set.seed()保证结果重现性。

  • 编写成函数function,其中参数k设定最近细胞数
make.knn.graph<-function(D,k){
  # calculate euclidean distances between cells
  dist<-as.matrix(dist(D))
  # make a list of edges to k nearest neighbors for each cell
  edges <- mat.or.vec(0,2)
  for (i in 1:nrow(dist)){
    # find closes neighbours
    matches <- setdiff(order(dist[i,],decreasing = F)[1:(k+1)],i)
    # add edges in both directions
    edges <- rbind(edges,cbind(rep(i,k),matches))  
  }
  # create a graph from the edgelist
  graph <- graph_from_edgelist(edges,directed=F)
  #取消节点的边框颜色
  V(graph)$frame.color <- NA
  # make a layout for visualizing in 2D
  set.seed(1)
  #指定layout_with_fr类型布局风格
  g.layout<-layout_with_fr(graph)
  return(list(graph=graph,layout=g.layout))        
}

函数中使用了layout_with_fr排版方式,并设置了随机种子,所以绘图结果稳定。但随着其它参数的改变,出图也会发生较大的改变。如下图分别绘制了最近5、10、30、50细胞的KNN图

ks <- c(5,10,30,50)
for (k in ks){
  g.pca20 <- make.knn.graph(pca$x[,1:20],k)
  # plot all 4:
  print(k)
  png(paste0("k",k,".png"))
  plot.igraph(g.pca20$graph,layout=g.pca20$layout,vertex.color=col.clust,
            vertex.size=1,vertex.label=NA,main=paste0("K",k,"--","50 PCs"))
  legend("topright",names(cols),col=cols,
       pch=16,cex=0.5,bty='n')
  dev.off()
}
image.png

以上介绍了如何利用igraph包可视化基于KNN的单细胞聚类关系。从结果来看就是从另一种方式展现单细胞的分类结果,以及分类的准确性。

2、igraph包简介

igraph是用于进行网络关系分析的开源工具,在R中有对应的R包


image.png

2.0 igraph的两要素vertices and edges与igraph对象

  • vertices节点,表示同一类别的具体实例,例如人名、地名、细胞、基因.....
  • edges边,连接两端的节点,以表示这两个节点存在联系(可进一步设置权重weight、方向direct)。
  • igraph对象是igraph包分析的中心,其储存着vertices与edges信息,以及对应的属性。

2.1 创建igraph对象

library(igraph)
#手动创建
g1 <- graph_from_literal( Alice-Bob-Cecil-Alice, Daniel-Cecil-Eugene,
                     Cecil-Gordon )
  • 如上表示A与B,B与C,C与A,D与C,C与E,C与G存在关系

但一般都不用graph_from_literal创建,更方便的是 graph_from_edgelist, graph_from_data_framegraph_from_adjacency_matrix三种函数更符合我们分析的需求。例如上面KNN绘图中使用的是graph_from_edgelist函数。具体可参看帮助文档。

2.2 了解igraph对象

g1

如下图igraph对象简介信息分为4行3类

  • 第1行重点关注那两个数字,前者表示节点(实例)总数,后者表示边(关系)总数。
  • 第2行表示属性attribute,分为三大类vertices(v) or edges(e) or graph(g)。例如本例中就只有节点vertices的names属性,为character类型。还可以进一步设置节点属性(set_vertex_attr())比如每个人的年龄,性别;边属性(set_edge_attr)如关系等级,互相打电话数等。函数vertex_attr, V and E用于查看igraph对象属性。
  • 第3、4行则主要具体展示了边的信息。


    image.png

2.3 igraph对象可视化

  • 直接使用plot函数即可
plot(g1)
image.png
  • 可视化过程涉及许多参数的设置,例如节点的大小/颜色/标签...,边的宽度/曲直/颜色....,还有最重要的是igraph提供多种多样的整体布局方式layout。如不特殊设置,均按照默认值。
  • 关于igraph绘图参数,可从3种途径进行设置。下图代码展示的是在绘图时,进行设置。
#设置随机种子,保证结果稳定
set.seed(1)
plot(g, layout=layout_with_gem, vertex.size=4,
     vertex.label.dist=0.5, vertex.color="red",edge.width=2)
image.png

此外tkplot()函数可绘制交互式结果,rglplot()函数可绘制3D结果


以上简单介绍了创建igraph对象--了解igraph对象--igraph可视化三个步骤,实际可进行多种多样的复杂分析(该包的函数帮助文档有400+页)。到时可结合需求,再了解下这个包,例如上面提到的KNN展示。

参考链接
1、Create a single cell Graph https://nbisweden.github.io/workshop-scRNAseq/oldlabs/igraph.html
2、igraph R package https://igraph.org/r/
3、igraph R manual pages https://igraph.org/r/doc/aaa-igraph-package.html

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