最近几期的文章介绍了一些辅助分子克隆实验的小工具，虽然功能很简单，还是费了很大功夫编写，最近确实很忙，不过趁周末终于把他们肝完了，本篇就对这些小工具做一个汇总，以暂时结束本系列。
这套工具包括八个子工具，共16个功能模块，近5000行代码，主要用于辅助分子克隆实验设计，希望能对你有所帮助。
工具集网址：http://liuzhen106.com/tools/
1 引物设计
PCR是现代分子生物学领域应用最普遍、最成熟的技术（没有之一），具有很强的稳健型，因此实践中似乎怎么随意的设计引物都能扩增成功，大多数情况下也确实如此。但是，3’错配、极不对称的Tm也可能导致PCR失败，尤其是使用复杂DNA模板时，精心设计的引物能够提高PCR扩增的成功率。
引物设计是本套工具集中最核心的工具，包括4个功能模块：克隆PCR、巢式PCR、qPCR(SYBR)、qPCR(Taqman)。设计原理我在之前的文章《PCR引物设计大法》中有详细介绍，主要考虑Tm、GC%、3’端错配，3’末端碱基种类等因素，构建一个评分函数，根据得分筛选出最佳引物对。程序化设计使得穷举大量引物成为可能，相当于把所有的引物组合都拉出来分析一下，这样就能够筛选出最佳的引物，因此本工具还是十分有实用价值的。下面分模块介绍一下他们的特点：
- 克隆PCR
由于必须扩增基因全长序列，就在序列的开头和末尾把所有18-30bp的引物拉出来，根据∆Tm < 3℃这一原则，选出得分最高的引物对。如果基因内部存在重复结构，程序自动示警但也就不再继续设计引物。在本模块中你可以正反向引物5’末端添加酶切位点，然后用于后继的酶切连接，引物以表格方式输出，点击复制按钮可以自动复制引物序列。
- 巢式PCR
巢式PCR是一种提高产物特异性的PCR方法，包括两轮PCR，第一轮在目标基因之外进行扩增，然后从扩增产物中扩增目标基因。一般适用于目标基因前后GC%不平衡的序列（如植物中的有些启动子），与其他基因存在同源性的基因等。使用该模块时，需要同时提供目标基因和一个更大的模板序列，输出外围PCR引物和目标基因的克隆引物。
- qPCR(SYBR)
依赖于SYBR染料的qPCR，使用方便、通用性强、价格不高，大众最爱。这种不需要设计额外的引物，但由于SYBR可以与所有dsDNA结合，容易受非特异性条带干扰，设计引物时应尽可能考虑特异性，推荐使用NCBI的PrimerBlast工具，它可以在基因组范围内分析引物的特异性。本模块未提供该功能，只能在输入的模板序列中寻找特异性最高的引物，一般输出200-500bp的靶标基因的引物，这是qPCR(SYBR)最普遍的长度，如果不能满足你的长度要求，可以使用“克隆PCR”模块代替。
- qPCR(Taqman)
qPCR(Taqman)除了上下游引物外，还需要一条探针序列，探针设计有特殊的要求，比如5’端第一碱基不能是G，Tm要比上下游引物高8-10℃，3’端不能连续4个G，探针应尽可能靠近上游引物等。本模块优先设计探针，再根据探针的位置设计上下游引物，可以选择探针两端的荧光标记，如果选择MGB标记，探针Tm会比上下游低5-10℃（MGB具有化学上提高探针特异性的作用）。
2 引物Tm计算
这个工具用于计算DNA引物的退火温度，传统的Tm = 2×(A+T)+4×(C+G)公式具有历史局限性，大量统计学研究已经得到了更准确的Tm预测公式，详情可查看之前的《PCR退火温度预测》。
3 核酸⇌蛋白
核酸与蛋白质序列互转工具，分为两个模块：核酸→蛋白质，蛋白质→核酸。核酸→蛋白质模块提供将DNA序列翻译成蛋白质序列的功能，还提供核酸序列的密码子分析（针对大肠杆菌宿主）。蛋白质→核酸模块将蛋白质序列转化为核酸序列，该步骤还提供密码子优化功能，此外该模块可以直接分析蛋白质序列的理论分子量、等电点和疏水性。
4 全基因合成
全基因合成是本套工具集中另一个比较核心的工具，其特点是利用59bp以内（普通引物合成的最大长度）的引物基于重叠延伸PCR获得木目标基因全长。按照引物搭桥的方式不同分为两个模块，“一正一反”和“一正多反”，点击标题栏的“+”按钮，可以查看对应方法的原理。该工具主要是省去人工一条一条去拉引物和计算重叠区的麻烦，程序保证所有引物间重叠区的Tm基本一致，这有利于各引物间均匀退火。输出的引物可以直接导入SnapGene软件进行复核，详细的设计原理及使用方法可以查看之前的《全基因合成方法》。
5 传统克隆
适用于传统的酶切连接克隆，可以选择单酶切和双酶切的方式，工具提供插入基因的内部酶切位点分析和引物设计，还提供重组质粒的完整序列生成，可以导入SnapGene进行复核。该工具允许添加一些标签，其中内置的是一些常用的纯化及检测标签，他们是可以修改的，你可以换成自己的标签。
6 Golden Gate克隆
TypeIIS型内切酶切割位点在识别位点之外，因此酶切后识别位点丢失，新插入的片段不会被重新切除，使用TypeIIS型内切酶的克隆方式称为Golden Gate克隆。同传统克隆相比，可以酶切连接同时进行，它即省去了DNA纯化回收的麻烦，还简化了实验步骤，是一种比较受欢迎的克隆方式。TypeIIS存在许多同尾酶，命名多样，但适合用于Golden Gate克隆主要有六种：AarI、BbsI/BpiI、BspMI/BveI、Eco31I/BsaI、Esp3I/BsmBI、SapI/LguI，本工具支持这六种内切酶。生成插入片段的克隆引物时，成有优先使用切割载体的内切酶，如果基因内部有该酶切位点，程序会自动选择其他酶切位点，如果你不想使用程序选择的酶切位点，你可以在序列内部插入该位点，再次生成引物程序会越过该位点使用下一个内切酶。但要注意生成的重组载体序列也会包含认为插入的碱基，你可以在SnapGene中将其去除。
7 简易克隆
Gibson克隆是Gibson等2009年正式公布的一种DNA组装方法，一次性可连入多个片段，操作简单，目前已经十分流行。本工具针对这种克隆方法提供辅助设计，根据线性化载体的方式分为酶切线性化和PCR扩增线性化，外加一个DNA用量计算模块。
- 限制性酶切线性化
Gibson克隆一般包括：线性载体制备，插入片段制备和片段重组。本模块适用于单酶切或双酶切的方式进行载体线性化，查看内切酶按钮可输出载体序列中的限制酶位点及数量，选择对应的限制酶进行酶切即可得到线性载体。允许插入1-5个插入片段，可以选择同源臂的长度，该长度是对所有片段通用的。
- PCR扩增线性化
该模块适用于利用PCR扩增的方式获得线性载体，需要指定插入位点上下游的DNA序列（用于插入片段的位置定位），PCR扩增务必使用高保真酶。
- DNA用量计算
一般，载体与插入片段的摩尔比应该为1:2-1:3，插入片段之间应该为1:1。当插入片段<200bp时，应该显著增加插入片段的用量1:8-1:10。本模块将摩尔比换算成纳克数，有利于配置重组体系的计算。
8 定点突变
本工具适用于编码基因的氨基酸突变，根据是否使用新的载体分为使用旧载体和使用新载体两个模块。设计原理为根据输入的突变位点，自动将野生型密码子替换为突变密码子，突变密码子选用大肠杆菌使用频率最高的同义密码子。通过突变引物和PCR扩增合成携带突变基因局部片段，片段间存在同源区（同源区长度按Tm=52℃来自动控制，这有利于重组反应的退火平衡），可以通过同源重组将突变片段一次性连入载体（相当于多片段Gibson克隆，适用于5个以内的突变片段），也可以通过重叠延伸PCR获得突变体全长序列后连入载体（相当于单片段Gibson克隆，适用于5个以上的突变片段）。