Nature Cell Biology | 活细胞动态RNA成像技术
原创 苏安 图灵基因 2022-07-01 09:13 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学技术
撰文：苏安
IF：28.824
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亮点：
本文的作者带我们回顾了RNA成像领域的研究进展，从固定细胞的成像到活细胞成像，从单分子RNA成像到多路RNA成像，从外源性成像到内源性成像，从静态成像到动态追踪，作者将RNA领域的成像技术向我们娓娓道来，并且在转录，翻译，剪接，降解等不同过程中向我们展示了各种成像技术的应用，并对新的趋势进行了讨论与展望。
为什么要研究RNA的成像技术呢？我们知道，从DNA到蛋白质的转变是以RNA为中心的一个复杂的、多阶段的过程，转录后，RNA分子开始进行剪接、定位、翻译和降解，这些步骤在空间和时间领域中都是高度协调和严格调控的，细胞内RNA的可视化技术能够帮助我们更加深入地研究代谢的过程。近期，美国加州大学圣地亚哥分校华裔科学家Gene W. Yeo在Nature cell biology 杂志上发表了一篇名为“Illuminating RNA biology through imaging”的综述文章，他带领我们回顾了RNA成像的发展历程以及各种成像技术在RNA代谢中的作用，并对RNA成像的趋势进行了讨论与展望。
RNA成像技术在固定细胞和活细胞中都在快速发展。在固定细胞中，目前的方法已经取得了高通量的成像，并能够定位和定量整个转录组的表达水平；在活细胞中，成像是低通量的，这个限制是由于每种颜色只能对应一种基因，但活细胞RNA成像的优势是通过成像分辨率的提高能够加深我们对RNA代谢动态的理解。
在固定细胞中，对于单分子的RNA成像，包括荧光原位杂交（FISH），滚环扩增（RCA-FISH），RNAscope，杂交链反应(HCR)-FISH和交换反应(saber)-FISH。1982年，Singer和Ward，通过结合的肌动蛋白信使RNA(mRNA)与2‘-脱氧尿苷-5’-三磷酸(dUTP)的DNA探针结合，首次证明了荧光原位杂交(FISH)。1998年，利用互补DNA(cDNA)寡核苷酸合成了单分子FISH(smFISH)。2008年，该方法被进一步改进，通过用48个DNA探针探测每个mRNA，每个探针都标记为单荧光色素，以单分子分辨率检测mRNA。滚环扩增(RCA)-FISH的原理是先杂交并将挂锁探针连接到特定的mRNA靶点，然后扩增挂锁探针。
在smFISH和RCA-FISH的基础上，为了进一步提高检测效率，提高亮度，降低总体成本。各个科研团队陆续开发了RNAscope，杂交链反应(HCR)-FISH和交换反应(saber)-FISH。RNAscope利用了多个平行的一级、二级和三级DNA寡核苷酸探针。杂交链反应(HCR)-FISH8和交换反应(saber)-FISH9分别用发夹探针和串联体放大初级探针，再沿初级探针铺设荧光二级探针。
在固定细胞中，对于多路RNA成像，主要包括组合FISH和原位测序。组合FISH为每个独特的RNA目标分配一个“光谱条形码”，条形码中的每个位在特定的一轮成像中对应于一个特定的荧光色素，增加条形码中的位数，可以指数级地增加可以检测到的唯一转录本的数量，MERFISH和seqFISH的后续开发都能够检测到10000个独特的RNA靶点。2013年，原位测序(ISS)技术利用RCA-FISH和连接测序(SBL)来扩增和读取条形码，并确定靶mRNA的位置。随着探针设计的改进，导致了一个新的条形码系统——基于杂交的ISS(HybISS)，这种新方法改进了RNA转录的空间检测。荧光原位RNA测序(FISSEQ)尝试对所有RNA进行无偏不倚的单分子测量。FISSEQ不是与挂锁探针杂交，而是与随机六聚体引物杂交。在多路RNA成像方法中，一个很有前景的新思路是使用在空间条形码载玻片上捕获的RNA。例如，最近开发的Seq-Scope利用下一代测序(NGS)化学，从捕获的RNA中生成簇仅为0.5-0.8μm。
表1.目前固定细胞中RNA成像方法的比较
活细胞中RNA的成像分为外源性成像和内源性成像。活细胞的外源性成像包括荧光标记的RNA，RNA茎环系统和荧光生成的RNA三类技术。1997年，Glotzer和他的同事将荧光标记的RNA微注射到果蝇卵母细胞中，以研究其短程和长程运输。1998年，Singer和他的同事开发了RNA茎环系统，以可视化酿酒酵母中定位于芽尖的ASH1mRNA。该系统由两个质粒组成，其中一个质粒编码一种绿色荧光蛋白(GFP)，与单链RNA噬菌体衣壳蛋白MS2的编码序列融合，也称为MS2外壳蛋白(MCP)。第二个质粒表达一个报告基因RNA，其中包含一个目标蛋白的编码序列，然后是6个MS2结合位点(MBSs)。除MS2外，还出现了其他RNA茎环系统，包括PP7、λN、U1A和BglG。在这些系统中，茎环的长度从15到29个核苷酸不等，其蛋白质结合伙伴的大小从22到129个氨基酸，MS2/PP7系统相对抗光漂白，MS2系统可以通过基因整合到内源性基因中，以研究活鼠脑组织中的mRNA动态。2011年，Jaffrey和同事报道了一种模仿GFP的RNA适配体。在GFP中，这三个残基Ser65-Tyr66-Gly67形成了一个荧光团结构，4-羟基苯甲基咪唑啉酮(HBI)。基于这一原理，作者通过指数富集(SELEX)对配体进行了系统进化，发现了一种RNA适配体，它可以包裹HBI，导致荧光。这三种方法是最早在活细胞中可视化RNA的方法之一，并阐明了RNA生物学的多个方面，但这些系统的一个缺点是无法成像内源性的、非转基因的mRNA。
活细胞的内源性成像包括化学合成探针和基因编码的探针。1996年，Tyagi和Kramer发明了一种名为“分子信标”的单链寡核苷酸探针，杂交后在目标RNA时发出荧光，这就是分子信标探针。另一种可视化内源性RNA的系统涉及在RNA合成过程中将荧光标记的dUTP合并到RNA中，该系统的一个局限性是因为荧光标记的dUTP可以整合到任何RNA中，所以它不能跟踪特定的RNA。关于基因编码探针，2016年，作者的实验室团队证明，通过RCas9与GFP融合，在活细胞中的RNA跟踪是可能的。2017年，Zhang和他的同事证明了Cas13a可以被设计成靶向哺乳动物RNA，并展示了催化活性Cas13a(dCas13a)与GFP融合的活细胞RNA成像。图1.亚细胞RNA成像技术发展史
RNA成像技术的进展增加了我们对RNA整个功能生命周期（转录、剪接、定位、翻译和降解）的理解。在转录阶段，使用MS2系统的活细胞RNA成像可以检测多种转录特性，亚细胞RNA成像不仅可以回答转录过程中的关键问题，并且转录位点活细胞RNA成像的技术可以促进我们理解转录机制。在剪接阶段，从时间尺度上，剪接的时间在20秒到几分钟不等，RNA的剪接是选择性剪接，将其进行成像，可以有助于理解选择性剪接在亚细胞定位中的精确作用。在定位阶段，RNA定位错误与多种神经退行性疾病有关，转录组测序研究已经确定了这些定位错误的mRNA。空间转录组学和活细胞RNA成像的出现使我们有了在更高的空间和时间分辨率下研究mRNA错误定位的能力。在翻译阶段，活细胞成像可以理解翻译的时间动态，而固定细胞RNA成像可以在更广泛的范围内研究翻译动态。结合smFISH和o-丙炔-嘌呤霉素的新生蛋白染色显示，肠上皮细胞的整体mRNA定位发生极化，导致翻译效率的极化。在降解阶段，降解被认为是一种诱导和维持RNA定位的机制。在rnp中运输的mRNA通常被保护不降解，确保正确传递到目的地。未来具有高时空分辨率的研究工具将有助于阐明RNA降解和定位之间的相互作用。图2.RNA成像技术在生命科学领域带来的多个亮点
随着固定细胞的mRNA成像已经从单一靶点发展到转录组规模，成像速度和图像分析仍然是亚细胞mRNA定位研究的瓶颈。人工智能在自动化细胞分割、RNA定位分配和斑点检测和跟踪方面的努力，将进一步推动我们目前对RNA定位的理解。除了扩大mRNA种类的数量外，成像内源性小RNA，如miRNA和RNA异构体的能力将大大提高我们对亚细胞分辨率下的RNA生物学的理解。RNA的加工不仅涉及RNA，还涉及DNA和蛋白质，将RNA成像与DNA和RBP成像相结合，将极大地提高我们对RNA生物学的理解，回答诸如染色体组织如何影响基因表达以及RNPs如何形成和组织等问题。此外，与高通量筛选研究的整合，如大规模RBP-RNA相互作用和CRISPR筛选，也将扩展我们的工具箱，以探索多维度的RNA。图3.RNA生物学多维方法的展望。
教授介绍：
Gene W. Yeo
Gene W. Yeo博士，是加州大学圣地亚哥分校（UCSD）的细胞和分子医学教授，基因组医学研究所的创始成员，UCSD干细胞计划和摩尔斯癌症中心的成员。Yeo博士是一位计算和实验科学家，为RNA生物学和治疗学做出了贡献。他的主要研究兴趣是了解RNA加工的重要性以及RNA结合蛋白（RBP）在发育和疾病中的作用。他的实验室开创了人类疾病相关系统中的计算算法和实验方法，以进行系统和大规模的研究。Yeo博士撰写了160多篇同行评审的出版物，包括神经变性，RNA处理，计算生物学和干细胞模型领域的特邀书籍章节和评论文章；并担任两本关于RNA结合蛋白生物学的书籍的编辑。
参考文献：
Le, P., Ahmed, N. & Yeo, G.W. Illuminating RNA biology through imaging. Nat Cell Biol 24, 815–824 (2022).