一文带你读懂单细胞测序

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单细胞测序技术自2009年汤富酬老师发表单细胞文献后被广泛了解，2013年被Nature Methods评为年度技术，至此越来越多地被应用在科研领域。2017年10X Genomics平台的建立才使得单细胞技术彻彻底底的传播开来。

单细胞转录技术（scRNA-seq）非常适合研究样本中各个细胞基因表达的异质性，其经典流程：分离单细胞（核），将RNA转换为cDNA，准备测序文库（illumina）后测序。

-  今天给大家分享的是单细胞下游数据分析  -

第一步、下载数据 

打开GEO数据库网站 Home - GEO - NCBI，选择Series板块输入“Single-cell Hepatocellular Carcinoma”搜索肝细胞癌的单细胞数据。

我们以肝细胞癌数据集GSE103867为例，点击GSE103867进入页面后，下拉至最末端，下载如下图所示三个文件。

 第二步、数据质控 

如下图所示我们将得到三张图片。第一张图为不同细胞中有多少基因表达；第二张图为不同细胞RNA表达的数量，即每个细胞中基因表达数量的总和；第三个图则代表线粒体的百分比，如果线粒体基因占比过高则说明有问题，有可能是细胞坏死。一般是占比在10%以下。

第三步、寻找高变基因 

一般情况下，细胞与细胞之间的基因表达趋于相似，就类似我们在bulk RNA测序时找差异基因一样，只有那种表达有显著差异的主要基因才会用于后续研究。而我们后面的降维聚类其实也是用的这里的高变基因。

第四步、降维聚类 

降维时，一般用PCA降维，默认会得到50个PCA主成分，而每一个PCA主成分其实代表了一种细胞的特征，根据这些特征的相似，将细胞聚类成不同细胞类群，如下图。

第五步、细胞注释 

我们在上面将细胞聚类成8个类群之后，但是我们还是不知道每个类群代表的是什么细胞，所以我们需要将细胞的名称注释上去。细胞注释有很多方法，可以通过手动筛选maker基因，查找文献之后注释，也可以直接用singleR注释。如下图就是singleR注释的结果。

第六步、细胞轨迹分析 

器官、组织会随着时间改变或者外界环境改变而改变，其根源是细胞的改变，那我们怎么才能知道一种细胞是怎么变化成另外一种细胞的呢，其中有那些基因参与了主要的过程，这就是细胞轨迹分析，也叫拟时序分析。

总结：以上是对单细胞测序下游分分析基本流程的一个讲解，当然单细胞测序肯定没有这么简单，后面我们会继续分享上面每个步骤的具体操作和一些注意事项，也会分享一些个性化的高级的单细胞测序分析方法。

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