全球单细胞测序平台介绍

2009年,单细胞测序技术问世。
2013年被Nature Methods评为年度技术。
2015年以来,10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技术的出现。
2018年以来,以新格元为代表的国内单细胞平台如雨后春笋般涌现。

Fig 0 单细胞平台一览图

一、低通量单细胞平台

低通量的单细胞平台主要是基于smart-seq2技术原理开发而来,典型代表有Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统和WaferGen ICELL8® Single-Cell System两大平台。

1、Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统
Fig1.1 富鲁达C1单细胞系统

  2012年6月13日,Fluidigm 在日本横滨举行的国际干细胞研究学会 (ISSCR ) 上发布了C1™ 单细胞全自动制备系统,是真正第一个实现商业化的平台。
  C1单细胞自动制备系统微流体技术,可以同时捕获多个单细胞(IFC:~96 cells;HT-IFC:~800 cells),在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程,完成smart-seq全步骤的自动化。

2、WaferGen ICELL8® Single-Cell System
Fig1.2 宝生物iCell8单细胞平台

  2015年2月份,Wafergen公司开发出ICELL8 Single-Cell System单细胞分选平台,后被TaKaRa公司收购。
  利用WaferGen Smart Chip TE平台筛选细胞,5184个反应孔,可进行单细胞RNA测序样本的制备、扩增、表达谱建库测序、生物信息分析,可快速得到样本间的基因表达差异。
  每次运行可分离500~1800个细胞; 细胞的捕获效率大约37%; 细胞适用范围为5-100um; 样本通量为8(一枚ICELL8芯片上一次最多可以分析8种细胞样品); 没有整合试剂,使用Takara试剂,需进行试剂优化; 自动成像技术系统:可实现单细胞反应孔可视化; 单细胞挑选软件:只挑选活的单细胞进入后续的处理,从而可以节约反应试剂,缩短数据分析时间。

[点评]
  • 虽然低通量测序现在不是市场上的主流,但是由于其实验的精密度是非常高的,已依旧没有被社会淘汰。

二、高通量单细胞平台(进口)

  2017-2018年,两大商业化的单细胞测序平台(10X Genomics, BD Rhapsody)出现,最终让单细胞测序技术进一步达到更大商业化。

1、 Mission bio:专注于高通量单细胞DNA测序的平台
Fig2.1 Mission bio Tapestri Single-cell Multi-omics Solution

  Tapestri平台基于微液滴的微流控装置,利用油包水体系对细胞进行捕获与封装。封装时,细胞和蛋白酶等会被一起装入微液滴中,每一个微液滴相当于一个微容器。之后,细胞在微液滴中进行裂解、加条形码(barcoding)等步骤,再结合靶向 PCR 扩增技术,对特定的DNA目标序列与蛋白产物进行单细胞水平的建库。建库完成后,即可进行高通量测序和后续的生物信息学分析。

  • 专注单细胞DNA测序。
  • 高灵敏度,可检测含量低至0.1%的罕见亚克隆,以及突变的合子型和突-变共发生情况。
  • 多种检测类型,可检测SNV、InDel及CNV等多种变异类型。
  • 高通量,每个样本可测量5,000~10,000细胞。
  • 灵活性强,可定制化设计疾病基因检测靶点及CRISPR靶点 。
2、Illumina® Bio-Rad®:基于数字PCR的高通量单细胞平台

  2017年1月17日,Illumina公司和Bio-Rad实验室公司在JP摩根健康大会上发布了Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution。

Fig2.2 Illumina Bio-Rad Single-Cell Sequencing Solution

  该系统包含Illumina® Nextseq 500和Bio-Rad® ddSEQ™ Single-Cell Isolator;Bio-Rad最好的液滴分离技术,Droplet Digital™技术,可以对单细胞进行隔离和编制条形码,然后在Illumina的许多主要NGS仪器上进行下游测序。

  • 可一次性检测8个样本,每个样本可以得到500~10000个细胞。
  • 捕获效率低,仅为3%,但测序成本相对较低。
3、10x Genomics Chromium 高通量单细胞平台(controller/connect/X series)

  10X面对市场不同的需求推出了三款仪器。最早的这一款就是chromium controller,这款仪器配备了是标准通量和低通用的两款试剂盒。2021年的时候,10X上又推出了chromium X series这款仪器,目前这款仪器也是市场主推的一款。它适配的试剂盒的规格也更丰富。


Fig2.3 10x Genomics Chromium 高通量单细胞平台

  另外10X推出的chromium connect仪器最大特点就是它能够实现从单细胞分离以及到最后NGS文库构建的一个全流程的过程,因此更加适合于一些大通量的实验室。

  • 每次运行提供8个通道,每个通道可以收集100-10000个细胞。(注:Chip M是16个通道)
  • 每次细胞分装运行时间为18min左右;
  • 细胞捕获效率最高可达65%;
  • doublet比例为0.9%/1000个细胞;
  • 针对单细胞ATAC分析,线粒体污染率低于2%;
4、BD Rhapsody™:基于微孔板法的高通量单细胞分析系统

  BD Rhapsody™单细胞分析系统包括BD Rhapsody™扫描仪和BD Rhapsody™ Express单细胞分析系统。BD Rhapsody™ Express 系统配备的专有单细胞捕获技术,以微孔为基础,稳定,能够捕获数百到数千个单细胞并为其打上条形码,分析基因组和蛋白质组信息。BD Rhapsody™扫描仪旨在可视化单个细胞捕获工作流程中的所有步骤,为每个步骤提供详细的分析度量,以便用户在整个工作流程中做出关键决策。


Fig 2.4 BD Rhapsody™单细胞分析系统
  • 单细胞捕获效率:最高可达~80%
  • 单细胞检测通量:100-40000
  • 双细胞比例: ~2-3% for 10k cells load; ~8-10% for 40k cells load
[点评]
  • 1)10x Genomics仍是主力军,在国内拥有众多代理商和服务商,占据着80%左右的国内科研市场份额。同时该平台近两年注重空间组学平台开发,2022年推出了一系列新产品;10x Chromium X系列产品有多种应用类型,支持低中高3通通量模式,在推广上又与之前的Controller进行联动(增加保修年限),是10x的主力机型。
  • 2)BD Rhapsody™平台坚持微流控微孔板的原理,配备有扫描仪,可以实时监测单细胞状态,保证细胞的分离捕获效率;同时其配套有抗体和流式平台,在单细胞实验的组合解决方案上有明显优势(混样、与流式仪器上下互动组合)。
  • 3)Mission Bio单细胞平台专注单细胞基因组测序,在血液肿瘤方向深耕多年,接触临床应用时间较早;近些年在逐步增加国内服务商的覆盖,已有多家知名服务商与之合作。
  • 4)Bio-Rad与illumina合作推出的单细胞建库平台捕获效率较低,市场占有率及市场声音较低。

三、高通量单细胞平台(国产)

截止到2022.12.31,国内的单细胞平台共有10个,分为微流控微孔平台(以新格元Matrix系统为代表)和液滴微流控平台(以华大C4系统为代表)。

1、Singleron Matrix® 自动化单细胞测序文库构建系统

可完成将单细胞悬液分散到微流控芯片的高密度微孔阵列中,并自动完成细胞分离、细胞裂解、细胞标记至mRNA捕获步骤,无需实验人员干预。


Fig3.1 Singleron Matrix自动化单细胞测序文库构建系统
  • 单个样本单张芯片可捕获细胞数量500-30000个;
  • 每份样本捕获效率最高可达75%;
  • 检测1000个细胞中含有双细胞的比例低于0.2%;

[点评]新格元生物是国内首家一站式全方位的单细胞整体解决方案提供商,在产品方面既有单细胞转录组、核转录组、免疫受体等常规产品,同时也有单细胞转录动态监测、单细胞糖基化、单细胞靶向基因检测试剂盒等特色产品,能够给科研者提供更加多样的组学研究选择。是国产单细胞的主要玩家之一。

2、华大智造:DNBelab C4高通量单细胞平台

  DNBelab C4是华大智造推出的基于负压的微流控单细胞技术。小巧轻便(长230mm、宽42mm、高57mm),无需电源,重量不到220g,操作简单,可随时开始单细胞建库。


Fig3.2 DNBelab C4 Pocket Single-Cell Lab
  • 有效捕获细胞数:1000~12000 cells/run;
  • 细胞直径范围:5µm-25µm ;
  • 多胞率(Multiplet Rate):<8% ;
  • 捕获效率:30~60% ;
3、寻因生物:SeekOne双平台体系(微孔板平台+液滴油包水平台)

  寻因生物有单细胞标记两大主流技术:油包水法SeekOne® DD和微孔芯片法SeekOne®MM(Microwell & Magnetic Beads)。
1)微孔芯片法MM
  SeekOne MM(Microwell & Magnetic Beads)高通量单细胞转录组试剂盒基于微孔技术原理,通过微孔芯片SeekOne Chip实现单细胞捕获,并利用核酸修饰的Beads 对不同细胞来源的RNA 进行分子标记,最终构建兼容Illumina及华大智造测序仪的高通量单细胞转录组文库。

Fig3.3.1 SeekOne MM平台(手动法)

  • 单次可放置1-4张芯片,单人操作可同时处理1-4个样本;
  • 单张芯片微孔数:17w;
  • 单张芯片捕获细胞数:500-10000 cells;
  • 捕获率:最高可达60%;
  • 双胞率: 0.7% / 1000 cells;
  • 无需其他昂贵硬件配套

2)油包水法DD
  液滴油包水平台(DD)是寻因生物的主力平台,并基于该平台开发了相应试剂盒,其主要有单细胞3‘转录组试剂盒和单细胞5’免疫受体试剂盒。

  • 芯片通量:1~8个样本,可以拆卸不会有芯片浪费;
  • 运行时间:3 min生成15万个油包水液滴;
  • 单通道细胞捕获:500-12000 Cells;
  • 双胞率:0.3% / 1000 cells;

[点评]寻因生物尽管对外宣称具有MM和DD双平台,但整体推广上仍侧重DD平台,并依托其可拆卸的芯片实现更加灵活的实验安排。目前该公司产品相对较单一,公司在推广上发力比较多,推出了相当多的视频专题进行客户教育,算是不错的行业先行者。

4、墨卓生物

  在过去的2022年中,墨卓生物对外发布了单细胞液滴微流控平台及其试剂盒、微生物高通量单细胞基因组测序产品。
其中单细胞液滴平台MobiNova-100引入了光激发分离(Light-CUT专利技术)原理,可以在单细胞核酸捕获阶段将分子标签与微珠进行分离,因此在实验中需要专门的配套设备。


Fig4.1 墨卓生物单细胞仪器
  • 芯片通量:1~4个样本;
  • 试剂盒种类:目前仅有单细胞3‘转录组试剂盒;
  • 运行时间:10 min;
  • 单通道细胞捕获:500-20000;
  • 双胞率:5% / 10000 cells;

  此外墨卓生物还推出了MobiMicrobe 微生物高通量单细胞基因组测序解决方案及其仪器产品M1,主要是在菌株水平分析宿主-噬菌体关联信息及转录转移事件。

  • 样本通量:每次可处理1个样本;
  • 捕获通量:每个样本可捕获微生物细菌数量≥6000个;
  • 仪器配套高速相机,能够观测微芯片中微滴发生和融合;
  • 仪器配有低温存储模块能,可同时放置4个0.2 mL PCR反应管和4个1.5 mL离心管;
  • 仪器配有扩增模块(96x0.2ml,12x8连管或96孔 PCR板)
  • 仪器带有自检功能:仪器在开机和运行过程中会自动检测,遇到异常会发出报警提示。
5、其他

  除了以上4个国产单细胞平台之外,在过去的两年中还出现过一些小众的平台公司,他们均采用液滴法来作为技术源头,并处于早期产品阶段,以单细胞转录组、免疫受体等作为主推产品,为客户提供产品或者服务。这些厂家有万乘生物(10K genomics)、百迈克生物、跃真生物(m20 genomics)、德运康瑞、纯迅生物等。

总结
  截至2022年12月,目前国内市场共有2个低通量进口品牌、4个高通量进口品牌和10个国产品牌,均有各自的公司定位和产品体系以及对应领域解决方案。
  纵览2022年国内市场单细胞信息,主要特点有:

  • 单细胞新平台频出。如墨卓,M20,百迈客均是2022年推出单细胞平台。
  • 单细胞平台特点突出,各有产品和市场定位,有从单品到一站式解决方法成长的趋势。
  • 单细胞市场更为成熟。各家单细胞平台对内完善了团队建设,对外加强服务商或产业端的合作。
  • 空间技术应用。10X主推空间原位,德运康瑞收购先能原位,华大和百迈客主推基于测序的空间技术。
  • 单细胞多组学,有单细胞平台的厂家基本在或计划开发单细胞多组学(免疫,表观,蛋白,突变,全长)产品矩阵。
  • 单细胞技术应用方向扩展到动物,植物,微生物。如联川,诺禾推出农口单细胞激励计划,BD联合华南农大推出经济作物单核文库构建方案。

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