随着测序技术的发展和应用的普及，研究者们在拿到大量的测序结果后，面临的困扰是怎样选择合适的结果验证策略。在这里，我们一起来了解一下高分文章中有哪些热门的验证方法吧，总有一种适合你。
Sanger
Sanger 测序原理（图1）[1]：选择的 DNA 序列是用一个测序反应制备的，其中脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）与终止的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）结合。每个链末端的核苷酸都用碱基特有的颜色标记。测序反应生成所有长度的片段，可以使用凝胶或毛细管电泳进行分离，其中标记的碱基显示每个位置的序列信息。读长度约为700bp。
结果图解：
RT-qPCR
定量逆转录 PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是定量监测某种RNA的一种试验方法。在该方法中，总 RNA 或信使 RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补 DNA（cDNA）。再以 cDNA为模板进行 qPCR 反应，利用琼脂糖凝胶电泳，确认RT-PCR 反应产物。RT-qPCR 已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA 干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。
结果图解：
WGS 和 WES 结果分析，发现特发性肺动脉高压新的易感基因PTGIS c.521 + 1G> A。为了验证其是否对PTGIS 基因转录本有影响，利用RT-qPCR检测到突变型（VAR）PTGIS 基因产生2个不同转录本，1条短且暗的条带（VAR-1）和1条长且亮的条带（VAR-2）。
对 qPCR 产物 Sanger 测序（图3，右图），揭示 VAR-1是内含子4区371bp被包含，提前终止翻译，导致 PTGIS 蛋白质功能不全。VAR-2 测序显示外显子4整个区域被删除，导致48个氨基酸片段缺失（p.Thr127_Arg174del）。
综合可知，RT-qPCR 和 Sanger 测序表明PTGIS c.521 + 1G> A 变异位点导致PTGIS 的 mRNA 转录异常。
Western-Blot
免疫印迹法（Western blotting, Western-Blot）原理是蛋白所带分子量不同在凝胶电泳中产生不同的电泳速度而被分离。转移固相到PVDF 膜或 NC 膜上。以固相中的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该方法广泛应用于基因组在蛋白水平的表达研究。
结果图解：
WES 关联分析，发现特发性肺动脉高压（IPAH）新的易感基因BMP9，为了验证BMP9 突变导致的有害结果，选择BMP9 的6个突变进行功能评估（S282fs 为截断突变，其余5个均为错义突变)。Western-Blot 的结果表明5个错义突变和野生型相比，pro-BMP9 蛋白水平的表达无明显差异，但成熟 BMP9（25KDA）水平均显著低于野生型（图4A）；截断变异 S282fs 并未检出 pro-BMP9 和成熟 BMP9（图4A、B）。表明这些突变对 BMP9 合成和装配有一定影响。
CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas 系统是原核生物的一种天然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的 DNA切断，沉默外源基因的表达。目前，被最为广泛应用的是 CRISPR-Cas9 系统，原理是在向导 RNA（guide RNA, gRNA）和 Cas9 蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组 DNA 将被看作病毒或外源 DNA，被精确剪切。可应用于基因敲除，基因替换等基础编辑方式，还可以被用于基因激活，疾病模型构建，甚至是基因治疗。
斑马鱼模型
目前，斑马鱼已成为一种公认的新型模式生物。斑马鱼体内存在的人类同源基因比例高达87%，某些疾病相关基因与人类基因保守性高达99%, 这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体,常被用来进行遗传病和肿瘤突变的功能验证。
结果图解：
文章中通过WES数据分析，发现含有UBA1 基因体细胞突变（p.Met41）的人，具有炎症综合症的表型。UBA1 因转录起始位点的不同，有两种亚型，UBA1a 和UBA1b。为了研究UBA1 亚型对炎性疾病的贡献，我们建立了CRISPR-Cas9编辑斑马鱼模型作为体内模型来评估基因功能。结果发现与 control 对比，△uba1 和△uba1b 斑马鱼的中性粒细胞数量低于野生型斑马鱼（图5A)、图5B)），且导致了斑马鱼炎症基因表达的上调（图5，E）。综上，敲除斑马鱼细胞质UBA1 亚型同源物可引起全身炎症。
小鼠模型
由于小鼠与人类的基因同源性高达78.5%，基因组93%的区域基因排列顺序与人类相同，生化指标及调控机制和人类相似，小鼠模型已经成为研究基因功能与致病机制、建立人相关疾病模型和评价研发药物安全性与有效性等生物医药研究的重要模型。
结果图解：
文章中通过 scRNA 测序分析，发现 NOTCH3 信号通路在血管周围和 CD90(THY1)+ 成纤维细胞分化起关键作用，这一步骤是炎症性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）发展所必需的。为了验证 NOTCH3 信号在 RA 中的作用机制，建立了小鼠模型（Notch3−/−小鼠模型和炎症性关节炎小鼠模型（通过静脉注射 K/BxN 小鼠混合血清诱导）），发现与野生型小鼠相比，Notch3−/−小鼠表现出关节炎疾病指数显著降低（p=3.01×10−16），脚爪肿胀显著降低（p=5.02×10−14）(图6 d, e)。此外，每周两次使用 NOTCH3拮抗抗体(anti-NRR3) 减轻了关节炎的严重程度（p=3.47×10−8）和关节肿胀程度（p=5.54×10−9）(图6 f, g)。
该研究推进了先前对 RA 中 NOTCH 信号的理解，为通过调节 NOTCH3 信号来靶向治疗 RA 提供了分子基础。
结合不同的验证目的，可将测序结果验证方法分为准确性验证类、功能验证类。Sanger 用于检测突变的准确性，RT-qPCR 常用于检测突变导致的转录表达情况，Western-Blot 可用于检测突变对蛋白合成的影响。此外，还有 CRISPR-Cas9 基因编辑技术结合动物模型，可模拟活体内突变导致的影响，常用的有斑马鱼模型、小鼠模型。大家可根据自己的需求结合各方法的优劣势来进行选择。
参考文献
[1] Pettersson E , Lundeberg J , Ahmadian A . Generations of sequencing technologies[J]. Genomics, 2009, 93(2):105-111.
[2] Wang XJ, Lian TY, Jiang X, et al. Germline BMP9 mutation causes idiopathic pulmonary arterial hypertension[J]. European Respiratory Journal. 2019,53(3):1801609.
[3] Wang XJ, Xu XQ, Sun K,er al. Association of Rare PTGIS Variants With Susceptibility and Pulmonary Vascular Response in Patients With Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension[J]. JAMA Cardiology. 2020,5(6):677-684.
[4] Beck DB, Ferrada MA, Sikora KA,et al. Somatic Mutations in UBA1 and Severe Adult-Onset Autoinflammatory Disease[J]. New England Journal of Medicine. 2020,383(27):2628-2638.
[5] Wei K, Korsunsky I, Marshall JL,et al.Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology[J]. Nature. 2020,582(7811):259-264.