1. 背景
介绍
CRISPR的全称Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，意为成簇规律间隔短回文重复序列，Cas则是CRISPR-associated (Cas) systems。
CRISPR/Cas 系统是原核生物的免疫系统，这个系统可以识别出外源 DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达，用来抵抗外源遗传物质比如噬菌体病毒和外源质粒的入侵。这与真核生物中RNA干扰（RNAi）的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas 系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中 CRISPR/Cas9 系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。
CRISPR/Cas9 利用一段小 RNA 来识别并剪切 DNA 以降解外来核酸分子。现在使用的 CRISPR/cas 9 系统是由最简单的 type II CRISPR 改造而来，该系统由单链的 guide RNA 和有核酸内切酶活性的 Cas 9 蛋白构成。
作用机理
⚠️nature video视频：CRISPR: 基因编辑原理及应用
人类基因组有两种方法进行断裂修复：NHEJ (不需要模板，随机修复，出错率高，引起基因knock out) 和HDR (需要模板，实现精准修复及knock in)。
Extended CRISPR techniques in recent years
技术路线
基因敲除：sgRNA+Cas9
基因敲入：sgRNA+Cas9+目的基因（HDR模版）
2. sgRNA的设计和制备
5‘端开始数20个碱基这一段是需要设计的，这一段用来识别目的基因上的靶标，并通过碱基互补配对原理与靶点位置结合。
gRNA再往后数76个碱基，是另一段transactiviting RNA (tracrRNA)。它的序列是一定的，就像转运RNA一样可以形成空间结构，然后就可以和Cas9酶相结合。
这样一条完整的gRNA就可以识别靶点，并且把与它自身结合的Cas9酶带到这个靶点，引导Cas9酶在靶点处对目的基因的双链DNA进行切断，从而达到基因编辑的目的。
目前又很多在线工具可以用于设计sgRNA
3. 靶标细胞导入
不同的导入方式基因标记效率和脱靶效率不同
4. 基因编辑效率确认
5. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design
CRISPR-DO网站：根据crispr motif sequence的结果，对给定基因的locus上查找哪段motif可能是最有效的
参考：
CRISPR实验究竟怎么做？手把手教给你
CRISPR/Cas9 基因编辑全套操作和解决方案（TAKARA 讲解）