【现学现卖】实时荧光定量PCR——qPCR

今天说一说qPCR。

1 qPCR简介

之前写过一篇文章笼统地介绍过PCR(【现学现卖】实验-PCR),多数是定性PCR,感兴趣的话可以看看。

这里先捋一下相关PCR的缩写吧。

容易误解的缩写

RT-PCR:Reverse transcription PCR/逆转录PCR。应用很广泛,凡是涉及一条RNA链逆转录为cDNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增都可以叫做RT-PCR,可能应用于定性PCR或者定量PCR。国际上约定俗成的一点是,RT指逆转录。

qPCR/ Real time PCR:Quantitative real-time PCR/实时荧光定量PCR。该PCR过程中每个循环都有数据实时记录,因此可以进行定量分析,有相对定量和绝对定量。

dPCR:Digital PCR/数字PCR。真正的绝对定量PCR,相比于需要借助其他分析的qPCR绝对定量,dPCR可以更加直接地给出DNA的拷贝数。

总之就是RT代表逆转录,q、d代表定量,而real-time就是很real的没有缩写。

关于它的原理,简单地说就是在PCR的基础上,利用其指数扩增特点,加上可以实时检测的荧光物质。

更多实验细节推荐阅读手册:

https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Images/china/PDF/real-pcr-handbook-web.pdf

2 qPCR数据

一、计算

qPCR中最重要的是Ct值。根据目的基因Ct和内参基因Ct的计算可以得到目的基因相对于内参基因的表达趋势。

首先介绍一下log2R数据分析方法,以2为底,对R求对数。

R=(1+E1)^ΔCt1(control-sample)/(1+E2)^ΔCt2(control-sample)

其中:

E1=目的基因引物扩增效率

E2=内参基因引物扩增效率

ΔCt1=实验组目的基因与内参基因Ct值差

ΔCt2=对照组目的基因与内参基因Ct值差

所以可以发现,当扩增效率E为1时,自然推导出常用的ΔΔCt法:

ΔCT = CT(target gene)−CT(reference gene).

ΔΔCT = ΔCT(target sample)−ΔCT(control sample)

即先用内参基因校准,再算样品与对照组间的差异,而我们的表达量的差异就可以表征为


计算和数据处理推荐阅读文献:

DOI https://doi.org/10.1038/nprot.2008.73

二、理想Ct值

对于内参基因,理想情况是各处理组和组内不同样品的测得Ct值稳定、相近;并通过样品浓度的调节,使之在15-25之间。我这里写的范围很大,参考了一些同学的建议,认为不用把范围定的太小,还是应该结合不同的实验,看看合不合适。

比如40个循环,某样品浓度下,内参是25,目的基因都40了,显然建议稀释样品到合适范围。

并且有人的目的基因可能Ct小于内参基因,因为目的基因在这个组织中是更加高度表达的,这个也有可能。

可以在实验最初多查阅资料,设立多个内参基因。

目的基因的Ct值范围更加宽泛(15-35吧),Ct太小(小于10),太大(大于35)的结果都不太可信。

如果通过样品浓度的调节无法改善Ct值,那么有样品污染(一些物质抑制PCR),引物设计(非特异性扩增),扩增效率(MgCl2含量或程序不合适)等很多可能。

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