The genomic landscape of metastatic clear cell renal cell carcinoma after systemic therapy
系统治疗后转移性透明细胞肾细胞癌的基因组图谱
发表期刊：Mol Oncol
发表日期： 2022 Mar 1
doi:10.1002/1878-0261.13204
一、背景
透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是成人肾癌中最常见的组织学亚型。原发性肾脏肿瘤的分子分析研究发现了许多基因改变，确定了VHL、PBRM1、BAP1和SETD2等基因中反复出现的功能丧失突变是致癌的关键驱动因素。
以前的研究通过定向下一代测序比较了原发肿瘤和转移部位的基因组图谱。这些研究显示，这些样本中VHL、PBRM1、BAP1或SETD2等基因的突变频率相当。一项使用配对的原发性和转移性肿瘤的多区域测序的研究显示，与原发性肾脏肿瘤相比，转移性肿瘤中富含9p和14q的拷贝数损失的克隆。众多系统性疗法可用于转移性ccRCC患者，包括血管内皮生长因子（VEGF）靶向治疗和免疫检查点抑制剂。在大多数患者中，这些治疗会引起反应或疾病的稳定，但最终患者在治疗中会取得进展。
二、材料与方法
1.数据来源
新鲜冷冻的肿瘤组织活检（n = 41）或FFPE肿瘤样本（n = 27）和外周血单核细胞（PBMC）
2.实验流程
1） 样品处理和全外显子组测序（WES）：肿瘤纯度是通过CLONET来估计的，CLONET根据配对的正常和肿瘤组织样本中334个单核苷酸多态性（SNPs）的分析来确定肿瘤组织的丰度
2） 数据处理和质量控制
3） 体细胞突变分析：通过内部的SNVseeqer管道在肿瘤样本中鉴定体细胞突变；为了校正表达水平和基因大小，并允许与TCGA数据进行比较，应用了MutSigCV算法；肿瘤突变负担（TMB）的计算方法是肿瘤基因组中非同义突变碱基的总数除以基因组覆盖的Mb
4） 体细胞拷贝数分析
5） 系统发育分析：高保真SNVs被用来生成系统发育树
三、实验结果
01 - 人口统计学和临床特征
44名ccRCC患者同意参加EIPM研究，并成功通过WES进行分析。大多数由非西班牙裔的白人男性组成（分别为n = 28和n = 36），中位年龄为65岁（范围38-86岁）。每个病人都是根据以前定义的IMDC预后标准进行分类。大多数患者（52%）被归类为中度风险，而32%和16%的患者为有利或不良风险。21名患者（47%）出现了转移性疾病。除WCMC-RCC-010患者外，其余所有患者在随访期间都出现了转移性疾病。大多数患者都有肺部（88%）、肝脏（36%）、骨骼（50%）、淋巴结（59%）或大脑（32%）转移部位的影像学证据。
各种疗法总结在图1A中进行了说明。大多数患者进行了肾脏切除术（n = 37，84%），并接受了系统治疗（n = 39，89%）。17名患者（39%）接受了姑息性放射治疗。血管内皮生长因子靶向治疗是最经常提供的系统治疗，其次是免疫检查点抑制剂治疗。帕唑帕尼（n = 23，52%）是最常用的药物，其次是舒尼替尼（n = 15）、阿西替尼（n = 11）、卡博赞替尼（n = 8）或其他药物（n = 15）。总共有20名患者接受了VEGF靶向治疗的一种以上治疗。从免疫检查点抑制剂来看，纳武鲁单抗是最常开的药物（n = 21），其次是ipilimumab（n = 5）和pembrolizumab（n = 3）。其他开始的系统性治疗包括mTOR抑制剂（依维莫司，替西罗莫司）、细胞因子（γ干扰素、白细胞介素2）和其他各种系统性药物。总共有13名患者（30%）接受了联合治疗，其中最常见的是纳武鲁单抗/伊匹利单抗（n = 5）或依维莫司/列伐替尼（n = 3）。
02 - 个体ccRCC患者的肿瘤采样时间和位置
总共有44名患者的68个ccRCC组织样本进行测序。图1B显示了队列中被取样的各种解剖部位。41名患者的样本来自不同的转移部位，包括肺（n = 17）、骨（n = 7）、淋巴结（n = 6）、脑（n = 6）和软组织（n = 6）。在三个病例中，只有原发性肾脏肿瘤被取样测序，而在11个病例中，有成对的原发性和转移性肿瘤样本。21名患者被诊断为转移性ccRCC，而23名患者最初表现为局部ccRCC，在中位数3.7年（范围0.2-11.7年）后出现转移性疾病。16名患者在随访4.6年（范围0.4-18.5年）后最终死于转移性ccRCC，而25名患者仍被积极随访。3名患者失去了随访。39名患者在病程中接受了系统治疗，其中VEGF靶向治疗（n = 36）、免疫检查点抑制剂（n = 23）和mTOR抑制剂（n = 18）是最常见的治疗方法。这些治疗的中位无进展生存期（在同一类别的多种药物情况下的最佳反应）分别为11.0个月（范围1.0-53.5个月）、4.8个月（范围1.4-28.8）和2.7个月（范围0.7-35.7）。
03 - 系统治疗后转移性ccRCC的体细胞突变情况
作者对来自43名转移性ccRCC患者和1名未发生转移性疾病的患者的68个肿瘤组织样本进行了WES。图2显示了患者队列中最常突变的基因。为了校正表达水平和基因大小，应用了MutSigCV算法。肿瘤抑制基因SETD2和PBRM1是队列中最频繁突变的基因，其他经常突变的基因是APC（43%）、VHL（36%）、KDM5C（31%）和HIF1A（24%）。虽然前述基因经常是靶向测序板的一部分，但也在多个病例中发现了RBM10（21%）和FBXW7（19%）的突变。大多数体细胞突变是错义突变，但特别是SETD2、PBRM1、VHL和KDM5C含有较高比例的潜在功能相关的无义和框移插入或缺失（indels）。为了确定这些突变频率是否与以前的研究有偏差，将本研究结果（WCM）与TCGA ccRCC研究（KIRC，图2）中的体细胞突变情况进行了比较。在本研究队列中，以转移性肿瘤为主的几个基因含有更频繁的突变，如SETD2、APC、KDM5C、HIF1A、RBM10、TRAK1和FBXW7，而与TCGA研究中分析的原发肿瘤相比，检测到VHL的突变率较低。
在68个肿瘤样本中，38个是在患者接受系统治疗后取样的，而30 个样本来自未经治疗的患者。两名患者在肿瘤采样前只接受了细胞因子治疗，而其他患者则接受了血管内皮生长因子靶向治疗（n = 36）、mTOR抑制剂（n = 15）或免疫检查点抑制剂（n = 7）的预处理。大多数预处理的患者接触了多条治疗线（24/38，63%）。作者比较了治疗前和治疗后获得的样本的突变频率。经过多重检验的校正，在任何一组中都没有检测到统计学意义上的突变基因富集。
为了研究某些突变是否参与了治疗耐药性，并因此在治疗后收集的样本中富集，作者分析了最经常突变的基因的变异等位基因频率（VAF）。发现SETD2、PBRM1、VHL和KDM5C的VAF在治疗前和治疗后的样本中没有统计学上的明显差异（图3A）。在其他经常突变的基因中，观察到TRAK1突变的明显减少，而EGFR突变在治疗后收集的样本中显示了更高的VAF（图3A）。TRAK1和EGFR突变分别存在于7名和4名患者的9和6个肿瘤中。观察到，在未接受治疗和接受预处理的样本之间，肿瘤突变负担（TMB）和插入/缺失频率没有统计学上的显著差异（图3B）。总之，这些结果表明，系统性治疗对转移性ccRCC的体细胞突变情况影响不大，并表明系统性治疗可能会诱发对含有EGFR突变的克隆的选择。
04 - 系统性治疗后转移性ccRCC的体细胞拷贝数改变
图4显示了队列中转移性ccRCC的体细胞拷贝数改变的整体模式。在3p25（n = 36名患者）、9p21（n = 30）和14q25（n = 17）检测到频繁的拷贝数丢失。作者检测到位于6号染色体（n = 18）和13号染色体（n = 23）的额外缺失，其中包括几个病例的6p21和13q14区域（图4A）。有趣的是，这些区域包含著名的肿瘤抑制基因RB1和CDKN1A（p21waf），它们都参与细胞周期的进展。作者在队列中检测到染色体5q臂的频繁扩增（n = 21）。作者比较了SCNAs在未接受治疗和预处理的肿瘤样本中的患病率。预处理的肿瘤样本中，6号染色体的缺失频率增加，但没有统计学意义。未接受治疗组和预处理组之间的总体SCNA负担相似（图4B）。观察到治疗组之间3p25、9p21、14q25和13q14的缺失频率没有统计学上的显著差异。总之，结果显示在转移性ccRCC肿瘤中，6p21和13q14有额外的染色体区域频繁的拷贝数丢失。
05 - 具有独特临床病程的选定病例的克隆演变
作者收集了13名转移性ccRCC患者的多个肿瘤样本，以便分析疾病的克隆演变。其中两名患者（RCC-007，RCC-058）有广泛的转移性疾病，临床进展迅速，在诊断后2年内死亡。相比之下，四名患者（RCC-008、RCC-048、RCC-006、RCC-015）的病程较缓，转移性ccRCC的总生存期相对较长（4.4-18.3年）。为了确定这两个群体是否显示出不同的进化模式，根据单个体细胞突变的VAFs构建了系统发育树，并对SCNAs导致的读取深度进行了校正（图5）。所有病例均显示系统发育树树干中 VHL 基因座的功能缺失突变或拷贝数缺失。
在两个病程缓慢的病例中（RCC-006，RCC-048，图5A），作者分析了原发肿瘤和转移部位，取样间隔时间为6.0和6.4年。在另外两个疾病进展缓慢的病例中（RCC-008，RCC-015，图5A），几个转移部位在死亡前或死亡后不久被取样。RCC-006、RCC-048和RCC-008显示出相对较低的SCNA负担，而RCC-015显示出各种亚克隆拷贝数的改变，这些改变在转移部位之间是不同的。这些肿瘤中的大多数似乎至少部分是由单个致病性突变驱动的，例如RCC-008的CCND3（p.S259A）和RCC-015的两个不同的PTEN突变（p.C136F，p.P95R）。RCC-006似乎是通过选择6号染色体拷贝数丢失的克隆与PDGFRB的致病性突变（p.R853W）而获得转移能力的，而RCC-048的转移是通过9p的拷贝数丢失与新型TP53突变（p.D241）的发展而演变的。
两位病情进展迅速的患者（RCC-007，RCC-058，图5B）均显示出与多个拷贝数事件的早期克隆固定一致的分子谱，包括所有肿瘤样本中3p25、14q25和13q14（RCC-058）或9p21（RCC-007）区域的丢失。总的来说，这些结果证实了先前的观察结果，即疾病的快速发展与多个克隆驱动因素的早期存在有关，而疾病过程的减弱与亚克隆多样化的分支演变有关。
四、结论
作者对转移性ccRCC标本进行了全外显子组测序。原发性和转移性ccRCC的基因组图谱似乎在3p25、9p21和14q25有频繁的CNVs。未来的工作将阐明RBM10和FBXW7突变以及6p21和13q14 CNVs在转移性ccRCC中的意义。