细菌基因组拼接（一）

2021.3.17
持续更新中。。。

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⭐总纲

• 材料：Illumina双末端测序原始数据（通常是两个fastaq的.gz压缩文件，文中为：sequence_1.fastq.gz和sequence_2.fastq.gz）
• 软件：FastQC、Trimmomatic、SPAdes、QUAST（均可通过conda一键下载）

1. FastQC —— 质量评估

FastQC是一款基于Java的软件，它可以快速地对测序数据进行质量评估，并生成网页版的报告。

1.1 使用

fastqc   -o <目录名> -t 线程数

重要参数
1. -o：输出文件目录（需要提前新建一个目录）
2. -t：选择程序运行的线程数
3. -f：指定输入文件格式

1.2 输出文件

每个原始数据文件会生成两个文件，一个为.html网页文件，一个为.zip文件。打开.html可以查看序列的测序质量情况，分为三个等级：合格项为绿色√，警告是黄色的！，不合格为红色的×。（绿色越多越好）

fastqc质量报告

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2. Trimmomatic —— 过滤

Trimmomatic用于illumina二代测序数据的reads处理，主要用于对接头(adapter)序列和低质量序列进行过滤。能够识别fastq的.gz和.bz2文件。主要有两种模式：双端模式（PE）和单端模式（SE）。

注：二代测序下机数据一般是150bp的序列，这些序列理论上全是自己的目标序列，但是有可能由于测通而含有接头序列。

2.1 使用(一条命令)

trimmomatic PE -phred33    
 <目录/sequence_1_paired.fastq.gz> <目录/sequence_1_unpaired.fastq.gz> <目录/sequence_2_paired.fastq.gz> <目录/sequence_2_unpaired.fastq.gz> 
 ILLUMINACLIP:~/miniconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/share/trimmomatic/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10:1:TRUE
 SLIDINGWINDOW:5:20 LEADING:20 TRAILING:20 MINLEN:75

重要参数
1. PE：指定为双末端测序（单端用SE）
2. -phred33将 reads 的碱基质量值体系转为 phred-33，也可以设置为phred-64。
3. ILLUMINACLIP：过滤 reads 中的 Illumina 测序接头和引物序列，并决定是否去除反向互补的 1/2 中的 2。ILLUMINACLIP参数后面的是.fa文件，用conda安装的话一般在miniconda3/pkgs/trimmomatic-0.39-1/share/trimmomatic/adapters/TruSeq3-PE.fa下，其中有两种文件可选：TruSeq3-PE.fa和TruSeq2-PE.fa，TruSeq3-PE.fa适用于Hiseq和Miseq机器测序，TruSeq2-PE.fa用于GAII机器测序。（TruSeq和Nextera是DNA建库常用的试剂盒）
4. SLIDINGWINDOW： 从 reads 的 5' 端开始，进行滑窗质量过滤。示例的意思是以5bp为窗口，若这5bp碱基的平均质量值低于20，则要进行切除。
5. LEADING：从reads起始开始，去除质量低于阈值或为'N'的碱基。
6. TRAILING：从 reads 的末尾开始切除质量值低于阈值的碱基。
7. MINLEN：如果经过剪切后 reads 的长度低于阈值则丢弃这条 reads。

可选参数
1. AVGQUAL：如果 reads 的平均碱基质量值低于阈值则丢弃这条 reads。
2. MAXINFO：一个自动调整的过滤选项，在保证 reads 长度的情况下尽量降低测序错误率，最大化 reads 的使用价值。

2.2 输出文件

一共会输出四个文件，其中双端序列都保留的序列在sequence_1_paired.fastq.gz和sequence_2_paired.fastq.gz中可以用于下一步的序列拼接。只保留一条的序列在sequence_1_unpaired.fastq.gz和sequence_2_unpaired.fastq.gz中。

过滤之后，还需要用fastqc对过滤后的数据进行质控，如果不符合要求，可重新更改参数进行过滤。

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3. SPAdes —— 短序列拼接

SPAdes是常用的序列拼接软件之一，支持illumina、PacBio、Nanopore、Sanger、Ion Torrent等测序数据的拼接，同样适合用于混合组装来改善拼接效果。

3.1 使用

spades.py --pe1-1  --pe1-2  
 -t 10  -m 100 --careful --phred-offset 33 -o 

重要参数：
1. --pe<#>-1：指定输入文库，其中#表示第几个文库。例如，第一pairend文库就可以写成--pe1-1，之后接reads1文件
2. --pe<#>-2：和上面类似，如果是大片段的matepair文库，就使用--mp1-1等。
3. -t：线程数，默认是16个。
4. -m：用于内存限制。
5. --careful：减少错误和插入序列，添加此项会消耗更多的时间。
6. --phred-offset：碱基质量体系，在数据纠错中会用到，现在illumina数据一般采用phred 33。
7. -o：输出目录

可选参数：
1. -k：k-mer值列表，数字必须是小于128的奇数。注：若小片段文库(150bp×2)数据量足够(50×+)，则推荐使用-k 21,33,55,77。
2. --pacbio：指定pacbio数据输入。
3. --nanopore：指定nanopore数据输入。

3.2 输出文件

着重关注文件*scaffolds.fasta和*contigs.fasta文件即可。

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4. QUAST —— 评价组装结果

4.1 安装

conda install quast

在用conda安装了FastQC、Trimmomatic、SPAdes后，环境中的python版本是3.9，安装不上QUAST了，在一个低版本的python环境下安装了QUAST。

4.2 使用

quast.py -o   -R  -t 25 <*scaffolds.fasta> <*scaffolds.fasta>

重要参数：
1. -o：输出目录
2. -R：参考基因组序列
3. -t：线程数

5. 总结

自己提取基因组送去公司测了以此框架图，回馈的原始数据深度达到了200×+，但是自己通过这个软件流程下来发现最后拼接得到的scaffold的数量有2000+！！！但是公司最后回馈的草图只有100条不到的scaffold数量。说明仅靠这些步骤拼接出来的质量并不是很高！！！