单细胞RNA测序技术?CRISPR-Cas9“基因剪刀”？How about 结合两大热门技术：CRISPR+ 单细胞测序 =？

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相信大家两大热门技术，单细胞RNA测序技术和CRISPR都耳熟能详。今天与大家一起学习一下近年来一个提出的一项热门技术：通过单细胞RNA测序的CRISPR基因筛选 （CRISPR droplet sequencing）。

知识回顾

首先先和大家简单回顾一下两门热门技术：单细胞测序和CRISPR魔剪。

单细胞测序

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单细胞生物学是当今热门话题。在这一领域中，最前沿的要数单细胞RNA测序（scRNA-seq）。传统“批量的”RNA测序方法（RNA-seq）可以一次处理成千上万个细胞，并得到变异的水平。对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间是有差异的。当然了，这个差异大小不一。相对比，scRNA-seq则可以揭示出每个细胞独特的微妙变化，甚至可以揭示全新的细胞类型。简而言之，单细胞测序就是在细胞层面上测序，进而回答相关的生物学问题。

CRISPR基因筛选(CRISPR screens）

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利用功能缺失的策略进行的高通量遗传筛选，是研究人员快速寻找调控特定表型的重要或关键基因的主要方法。CRISPR技术的兴起，使高通量筛选基因更加快速简便，并能准确的实现基因组敲除等编辑功能，因而成为一种强大的遗传筛选工具。相比之前的RNAi干扰的方法，应用CRISPR技术进行的基因敲除更加稳定，确保基因功能完全缺失，是研究人员快速发现新靶点新基因的重要方法。

为什么需要把两种技术结合起来？

CRISPR基因筛选，可以通过 CRISPR gRNAs 靶向不同细胞中成百上千各异的基因，然后通过实验筛选编辑细胞，gRNA 可以帮助确定哪些基因对于生物学作用机制具有至关重要的作用。然而，这种筛选方法比较适用于回答与细胞生长能力直接相关的问题，例如鉴定保护癌细胞免受化疗或免疫细胞抵抗HIV感染的基因。然而，如果我们想研究基因调控和其它复杂的生物控制机制，就要明白多个基因是如何协同工作还有调控调节细胞状态。这就需要针对每个CRISPR靶向基因，分别进行培养，编辑和分析细胞。这样的过程既操作繁琐，又费用昂贵。另外，传统单细胞测序由于细胞筛选导致的不足，常常无法直接用于筛选编辑基因。

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由于上述两种原因，我们需要一种新的技术，将两种技术的优势相结合，克服各自技术的不足。所以科学家创造性地发明了CROP-seq（CRISPR droplet sequencing，CRISPR液滴测序）。这种技术能大规模完成前所未有的高通量基因调控的分析。类似于混合筛查，这新方法使用CRISPR-Cas9系统在单个样本中并行生成多达数千个遗传扰动，利用单细胞RNA-seq（scRNA-seq）作为读数，同时测量每个细胞的扰动和表型。

应用实例

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Jaitin DA 等人利用CROP-seq表明了使用同一单元格分析基因组扰动和转录组，可以使我们能够同时阐明多种因素的功能及其相互作用。他们使用CROP-seq成功探测关于先天免疫的调节回路的问题。通过对体外和小鼠中数以万计的干扰细胞进行取样，他们鉴定了发育和信号相关因子之间的相互作用和减少。这些包括Cebpb和Irf8在调控单核细胞/巨噬细胞与树突细胞谱系方面的相反作用以及单核细胞中的Rela和Stat1 / 2与病原体对树突细胞的响应的差异功能。这研究证明CROP-seq是可以用于广泛不同的研究领域，进而全面阐明哺乳动物是如何控制特定的回路。

参考：

1. Nature新技术:CRISPR 单细胞测序=? http://www.cmt.com.cn/detail/1282457.html
2. 怎样追上CRISPR技术快速发展的步伐？https://www.cyagen.com/cn/en/community/frontier/information-20170308.html
3. Jaitin, Diego Adhemar, et al. "Dissecting immune circuits by linking CRISPR-pooled screens with single-cell RNA-seq." Cell 167.7 (2016): 1883-1896.