一个针对FLT3中驱动突变的T细胞受体在体内介导了白血病的消除

今天给同学们分享一篇实验文章“A T cell receptor targeting a recurrent driver mutation in FLT3 mediates elimination of primary human acute myeloid leukemia in vivo”，这篇文章发表在Nat Cancer期刊上，影响因子为22.7。

结果解读：

从健康供体T细胞中诱导FLT3 D835Y -反应性T细胞

来自16名HLA-A2阳性健康献血者的幼稚T细胞与自体单核细胞源性树突状细胞（moDCs）共培养，这些树突状细胞经过电穿孔处理，携带编码FLT3突变的9个和10个氨基酸肽的mRNA，这些肽被预测为与HLA-A2强结合（扩展数据图1a）。序列在N-末端和C-末端分别有9-11个氨基酸（目标mRNA，编码KICDFGLARYIMSDSNYVVRGNVRLARLP），或者是对照mRNA。共培养10天后，细胞被染色，使用双色肽-MHC（pMHC）多聚物与非聚合性或十聚合性肽结合，其中FLT3突变位于位置1。只有一个献血者的9个氨基酸反应性CD8 T细胞与多聚物结合，并且只在目标mRNA处理的培养中检测到，并进行了分选。从两个克隆和55个分选、测序的单个细胞中，仅鉴定出一个功能性TCR序列（TCR）（图1b和扩展数据图1b、c）。

TCR FLT3D/Y 识别具有高肽- HLA 稳定性的突变肽

TCR序列通过逆转录病毒转导在第三方PB T细胞中高效表达（图1c）。通过免疫肽组学和靶向质谱分析，证明了其与HLA-A2的结合以及肽段的内源性加工和呈递，使用过表达FLT3突变的单等位基因细胞系作为阳性对照，对来自两名AML患者的原代细胞进行了分析（图1d，使用前体→b2、b3、b4、b5、b6、b7和b8片段离子交易提取的离子色谱图，以及扩展数据图2）。作者先前证明了肽段-HLA稳定性与新抗原免疫原性之间存在强相关性，突变肽段与HLA-A2形成的复合物的半衰期几乎是WT肽段与HLA-A2形成的复合物的十倍（平均为9.9小时对0.83小时，n = 3）（图1e）。与此一致，TCR细胞与呈现突变肽段的pMHC多聚体明亮染色，而不与WT肽段结合（扩展数据图3a）。TCR FLT3D/Y -重定向的CD8 + T细胞的类似部分与FLT3 D/Y pMHC多聚体和抗小鼠TCR-β–PE（对引入到TCR 40 中的小鼠常数区域反应）呈阳性染色，并与抗人类TCR-α呈阴性，表明引入的TCR-α和TCR-β链的优先配对和内源性TCR的抑制（扩展数据图3b,c）。CD8 + 和CD4 + T细胞均表现出主要是天然状态的特征，并且在体外扩增的程度与转导表达对照TCR的T细胞（临床应用的NY-ESO1特异性1G4 TCR 1G4 ）相似，表明没有兄弟杀伤（扩展数据图3d,e）。

TCR FLT3D/Y 细胞显示出高度的肽段敏感性和特异性

TCR FLT3D/Y 细胞识别到表达HLA-A2并且脉冲处理了皮克摩尔浓度的突变肽的K562靶细胞（半最大有效浓度（EC 50 ）= 81 pM），并且对应的野生型肽没有显示出反应性（图（图1f））。相比之下，TCR 1G4 细胞识别到与之配对的NY-ESO1肽，其EC 50 为5.5 nM（扩展数据图（图3f）），与先前的数据一致，显示出EC 50 为7.7 nM 42 。此外，除非预先加载了突变肽，否则TCR FLT3D/Y 细胞对26个不同组织来源的HLA-A2 + 细胞系的面板几乎没有或没有反应性，表明具有高度的肽和HLA特异性（图（图1g1g）。

作者接下来对TCR FLT3D/Y 的精细特异性进行了映射。筛选TCR FLT3D/Y 细胞对负载了161个肽段的靶细胞的干扰素（IFN）-γ产生的反应，这些肽段代表了认同肽段的单氨基酸替代变体（图1h和扩展数据图4a）。通过使用ScanProsite工具（https://prosite.expasy.org/scanprosite/）在人类蛋白质组数据库UniProtKB/Swiss-Prot中查询每个位置上包含任何“允许”的替代氨基酸的肽段模体（扩展数据图4b），在人类蛋白质组中鉴定出了28个可能被TCR FLT3D/Y 细胞识别的9个氨基酸肽段（补充表1）。然而，只有其中三个肽段（肽段11，AVISDAMYI，来自LZTR1；肽段12，YITSDMFYV，来自MED1；肽段15，AVDNDSFYV，来自PRADC1）激活了TCR FLT3D/Y 细胞（图1i）。根据HPA数据库（https://www.proteinatlas.org/），编码携带潜在交叉反应肽段的这三个基因在人体中广泛表达。对于26个HLA-A2 + 细胞系的反应性缺乏观察结果（图1g），因此暗示这些肽段没有被处理和呈现。为了进一步排除这一可能性，作者生成了编码30个氨基酸的肽段的mRNA构建物，其中交叉反应的肽段位于中间，两侧是天然相应的蛋白序列和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因（扩展数据图4c）。共培养实验证明，TCR FLT3D/Y 细胞对于电穿孔了LZTR1、MED1或PRADC1肽段编码的mRNA构建物后的K562 HLA-A2 + 靶细胞没有反应（图1j和扩展数据图4d），表明这些肽段在HLA-A2上没有被自然处理和呈现。与此一致，28个候选肽段中没有一个在HLA配体数据库 43 中找到。

TCR FLT3D/Y 细胞在体外杀死原发性FLT3 D835Y AML细胞

对49名AML患者的公开可获得的DNA测序数据进行重新分析，发现FLT3 D835Y 突变 15 的克隆体经常占主导地位（扩展数据图图5a）。FLT3 D835Y 突变在22名患者（45%）中的变异等位基因频率（VAF）最高，是已知的复发驱动单核苷酸变异（SNV）和插入缺失（indels）中的最高频率。在另外两名患者中，它仅在复发的SRSF2和TET2突变之前出现，已知这些突变在正常个体中存在克隆性造血系统疾病（CH），需要额外的驱动突变才能转化为AML 44 。类似地，对单细胞DNA测序的AML进行重新分析显示，在9名FLT3 D835Y 突变患者中，它具有最高的VAF或仅次于与CH相关的突变 45 （扩展数据图图5b）。总之，对58名FLT3 D835Y 突变的AML患者的分析表明，FLT3 D835 经常是克隆性的，并且可能构成AML的起始或转化突变。

作者接下来探索了TCR细胞对11名AML患者（附表2）的特异性和效力。通过对以髓系细胞为主的单核细胞样本进行DNA测序（图2a和扩展数据图6a），发现8名FLT3患者中FLT3克隆参与度较高（图2b和附表3）。TCR细胞以低至1:2的效应细胞：靶细胞（E:T）比例有效地杀死了1-7号AML患者的髓系细胞（平均87%，范围53.3-98.7%，图2c、d）。CD3 T细胞和CD19 CD20 B细胞的影响不显著（图2c、d和扩展数据图6b），这是由于克隆参与度较低所致。然而，B细胞计数非常低（扩展数据图6a、b），因此作者还研究了TCR细胞对健康供体的分离B细胞的影响，结果显示没有杀伤作用（扩展数据图6c）。通过对髓系HLA-A2 FLT3患者细胞（患者8）的杀伤缺乏，证实了TCR的HLA限制性（图2c、d）。对FLT3的D835Y替代的特异性通过对D835位置中具有其他氨基酸替代（患者9和10）或表达FLT3 WT （患者11）的AML样本的识别缺乏证明（图2d和补充表2）。在TCR FLT3D/Y 细胞与HLA-A2 + FLT3 D835Y 患者细胞（患者1-6；扩展数据图6d）共培养时观察到强大而特异的IFN-γ产生。最后，从AML患者中获得的TCR FLT3D/Y 细胞以与第三方T细胞相似的效力和选择性杀死同种自体白血病细胞，模拟临床环境（图2e和扩展数据图6e）。大多数情况下，每个患者样本进行了两到四次实验，只有在少数情况下由于材料有限而进行了一次实验，如图例所述。

TCR FLT3D/Y 细胞在体内高效地靶向人类白血病细胞

作者最初通过在体异种移植小鼠模型中使用一种白血病细胞系进行的小规模实验，调查了TCR FLT3D/Y 细胞是否能够识别内源性呈递的抗原。由于FLT3 D835Y 白血病细胞系在商业上不可获得，作者将该突变引入不同的白血病细胞系，并证明TCR FLT3D/Y 细胞在低E:T比率（1:2）下在24小时内杀死了超过95%的白血病细胞（扩展数据图7a、b）。接下来，作者将表达FLT3 D835Y 的BV173细胞（细胞系起源于B细胞前体白血病）移植到NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ（NSG）小鼠中（扩展数据图7c、d）。对照组（未处理组（n = 3）和TCR 1G4 细胞组（n = 3））的所有小鼠在21天后因高白血病负荷而被杀死，此时TCR FLT3D/Y 细胞处理组（n = 4）中的白血病细胞无法检测到（扩展数据图7e、f）。在接受治疗性TCR的四只小鼠中，有两只在整个实验期间存活（53天），一只虽然没有白血病但在第41天因移植物抗宿主病而被杀死，而另一只在第28天复发并在第32天被发现死亡（扩展数据图7e）。7e)。终止后，在两只接受TCR FLT3D/Y 细胞治疗的小鼠的骨髓（BM）中未检测到白血病细胞（扩展数据图7g，h），而BM中的转导T细胞持续存在（扩展数据图7i）。

TCR FLT3D/Y 细胞在PDX模型中高效消除原发性AML

为了研究TCR FLT3D/Y 细胞在与疾病相关的模型中的体内疗效，作者接下来治疗了移植了不同PDX模型中的原发性AML细胞的小鼠。

模型1

NSG-SGM3小鼠高度移植了来自患者7的原发FLT3 D835Y AML细胞（PB中人类CD33 + 细胞占24.5% ± 2.2%）（图3a，b和补充表2和3），接受了TCR FLT3D/Y （n = 7）或对照TCR 1G4 （n = 6）细胞的治疗。PB的连续分析显示，TCR 1G4 -治疗小鼠中CD33 + 移植物维持高水平，而所有TCR FLT3D/Y -治疗小鼠中的CD33 + 细胞在第14天几乎被消除（图3b和扩展数据图8a）。对于通过转导表达来自第三方供体的TCR的T细胞可能介导的内源性TCR介导的潜在异体反应，作者对所有TCR 1G4 -治疗和TCR FLT3D/Y -治疗小鼠进行了终端分析，该分析在T细胞输注后的第15天进行，此时肿瘤负担开始稍微下降，对照小鼠中也有相同情况（图3b）。BM分析显示，TCR 1G4 -治疗小鼠中高水平的CD33 + AML移植物（平均86.9% ± 5.3%）减少至平均0.5% ± 0。在TCR FLT3D/Y 处理的小鼠中，FLT3 D/Y AML细胞在骨髓中几乎完全消除，这一点通过液滴数字PCR（ddPCR）分析得到确认，该分析定量克隆相关细胞（图3e和补充表4）。重要的是，在TCR FLT3D/Y 处理的小鼠中，对人类AML细胞的有效靶向治疗导致小鼠造血功能的恢复，而在TCR 1G4 处理的小鼠中，由于高白血病负荷而严重抑制了小鼠的造血功能（图3f和扩展数据图8b、c）。在整个实验过程中，检测到表达TCR的T细胞存在于所有小鼠的骨髓、脾脏和外周血中（图3g和扩展数据图8d-g）。

模型2

第一例FLT3突变的AML样本的原代异种移植在NSG-SGM3小鼠中移植（患者1，附表2）被用于研究对TCR细胞的反应（图4a）。与患者7不同（图3c），这种AML共表达CD34，这是CD34 AML的干细胞和前体标记物，而已经证明CD34细胞与CD34细胞相比具有白血病传播活性。对照组TCR处理的小鼠在T细胞注射后34天PB人类CD33移植水平相对较低（平均为6.0% ± 3.1%人类（h）CD45 CD33细胞），而BM移植水平则较高（平均为23.7% ± 5.8%）（图4b，扩展数据图9a，b和附表6）。在TCR处理的小鼠中，PB中的移植水平降至1.9% ± 0.7%，BM中的移植水平降至1.7% ± 0.3%（扩展数据图9a，b）。在T细胞注射后的第34天，终末BM分析显示对照组TCR处理的小鼠中存在明显的CD33 CD34细胞群体（平均为19.4% ± 4.8%）和CD33 CD34细胞群体（平均为4.4% ± 1.0%）（图4b，c）。在TCR FLT3D/Y 处理的小鼠中，尽管水平大大降低（平均1.7% ± 0.3%），但一些CD33 + CD34 − 细胞仍然存在于骨髓中，而CD33 + CD34 + 细胞完全被消除。在外周血和脾脏中也观察到类似的结果（图4c和附表6）。

模型3

为了建立一个模拟最小残留疾病（MRD）的PDX模型，作者将来自患者1的AML细胞移植到NSG小鼠中，并进行了二次移植，NSG小鼠是一种与NSG-SGM3小鼠相比，不特异性增强人类髓系细胞的小鼠品系。与NSG-SGM3模型的结果一致，作者观察到在这种MRD环境中，FLT3原发性AML细胞也被有效清除（图5a、b和附表9）。

模型4

TCR治疗导致患者1的AML细胞在外周血、脾脏和骨髓中的CD34 FLT3水平无法检测到，与通过特异性TCR靶向在体内完全消除FLT3 AML增殖细胞相符。然而，要更确切地支持这一点，需要对小鼠进行更长时间的随访，以便可能出现逃避T细胞识别的罕见和耐药AML干细胞的潜在生长。由于TCR T细胞具有内源性TCR重排，随着时间的推移会引起异基因反应和异种反应，因此在模型1-3中无法进行长期随访。此外，要确定是否所有AML增殖细胞都已被TCR细胞消除，需要在没有TCR T细胞的情况下进行评估。为了克服这些限制，将患者1的AML细胞与TCR或TCR细胞一起或在体外无T细胞培养48小时后移植到NSG小鼠中（图5c）。AML细胞在体外接触的极少数人类T细胞在体内没有持续存在（扩展数据图10）。小鼠没有接受白细胞介素（IL）-2的输注。因此，可以在28周内跟踪潜在的AML发展。在此期间，注射了来自没有T细胞或带有控制TCR 1G4 细胞的对照培养物的AML细胞的小鼠显示出进行性和高水平的白血病移植。相比之下，任何时候移植了与TCR FLT3D/Y 细胞共培养的AML细胞的小鼠中都没有观察到可检测的移植。综合这些实验表明，TCR FLT3D/Y 细胞能够有效地靶向和消除FLT3 D835Y 突变的体内AML细胞。

总结

TCR可以访问目前对CAR不可及的复发性突变。此外，相对于CAR，TCR可能具有固有优势，可以提高T细胞的持久性和抗原敏感性。如今，基于TCR的治疗主要以基因修饰的T细胞形式应用，尽管可溶性双特异性TCR结合剂作为低成本的现成疗法机会已经出现。这里呈现的结果表明，针对来自健康供体的单一共享新抗原的TCR可以在多个与疾病相关的模型中提供高效且特异的癌症治疗，为未来的现成、肿瘤特异性免疫疗法铺平了道路。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎咨询！