FDU生化总结-蛋白质化学2

肽键：一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键。肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的6个原子处于同一平面，肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转，在大多数情况下以反式结构存在。

残基（residue）：氨基酸连接成肽链后，肽链上的一个氨基酸单位被称为残基，带有游离α-氨基的一端被称为氨基(末)端(或N端)，带有游离α-羧基的一端被称为羧基(末)端(或C端)。

谷胱甘肽（Glutathione，GSH，GSSG）：GSH可被氧化成GSSG，GSH作用在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原状态。例如，它可防止H2O2将红细胞中血色素的二价铁氧化成三价铁形成高铁血红蛋白。

催产素（oxytocin）：由垂体后叶制造的 9肽，能刺激子宫收缩；

舒缓激肽（bradykinin）：9肽，能使呼吸道平滑肌收缩，抑制组织炎症。

甲状腺素释放因子（TRH）：3肽，下丘脑分泌，能刺激垂体前叶促甲状腺素释放，发挥作用浓度极低。

脑啡肽（enkephalin）：神经递质的一种，能改变神经元对经典神经递质的反应，起到修饰经典神经递质的作用，又称神经调质（neuromodulator），又被称为“脑内吗啡”。

牛催产素（oxytocin）：引发分娩时的子宫收缩，刺激乳汁分泌。减少肾上腺酮等压力激素水平，降低血压。

牛加压素（vasopressin）：又名抗利尿激素，可调节细胞的进水量，增加肾中水的重吸收，并刺激血管收缩而增加血压。

鹅膏蕈碱（Amanita phalloides，Α-Amanitin）：双环8肽毒素，分泌与毒蘑菇，对动物有致死作用，真核生物RNA聚合酶II有抑制转录作用。

多亚基蛋白质：含有两条或更多条非共价结合的多肽链的蛋白质。

原体：不同的亚基形成小的寡聚体(oligomer) ，并以此进一步装配。这种小的寡聚体被称为原体。

胰岛素：胰岛β细胞分泌的，受到内源性或外源性物质如葡萄糖刺激分泌的蛋白质激素，能够降低血糖。胰岛素的两条多肽以二硫共价键连接，不是多亚基结构。

天冬氨酸氨甲酰磷酸转移酶由6个调节亚基（R）和6个催化亚基（C）组成，装配时先由1个C亚基和1个R亚基组成一个原体CR ，再由6个原体装配成一个有活性的酶。

从蛋白质的大小估算氨基酸残基数：

可以从一个不含有其他化学基团的蛋白质分子估算其中的氨基酸残基的大概数目，用蛋白质的分子量除以110，即为组成氨基酸的数目。

【20种氨基酸的平均分子量为138，较小的氨基酸在多数蛋白质中的丰度高，如果考虑不同氨基酸在蛋白质中出现的比例，氨基酸的平均分子量只有128，形成肽键时失去一分子量18的水分子，因此，蛋白质分子中氨基酸残基的平均分子量为128-18=110。】

二面角(Dihedral Angle)：肽键平面之间的α-碳原子，可以作为一个旋转点形成二面角(dihedral angle)，绕Cα-N键轴旋转的二面角（C-N-Cα-C）称为φ，绕Cα-C键轴旋转的二面角（N-Cα-C-N）称为ψ。

寡聚蛋白质：几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。可用8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。

蛋白质的酸水解：常用6 mol/L HCl或4 mol/L H2SO4在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是Trp被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如Ser或Thr有一小部分被分解；Asn和Gln侧链的酰胺基被水解成了羧基。

蛋白质的碱水解：一般用5 mol/L NaOH煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是Trp在水解中不受破坏。

蛋白质的酶法水解：用于蛋白质肽链断裂的酶称为蛋白水解酶（proteolytic

enzyme）或称蛋白酶（proteinase）。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。蛋白酶分为内切酶（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶）和外切酶（羧肽酶、氨肽酶）。

胰蛋白酶（Trypsin）：属于内切酶一类，水解位点为Lys（K）和Arg（R）的C端，但若其C端连接的是Pro则水解会被抑制，该酶专一性强，水解速度快。

胃蛋白酶（Pepsin）：属于内切酶一类，水解位点为Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其他疏水性氨基酸的N端，如果其N端连接的是Pro则水解会被抑制，该酶水解速度快，胃蛋白酶一般处于pH2的环境。

糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：属于内切酶一类，水解位点为芳香族氨基酸的C端，如果其C端连接的是Pro则水解会被抑制，存在于pH8·9的环境。

嗜热菌蛋白酶（Thermolysin)：属于内切酶一类，水解位点为水解位点为除了Pro和Gly的疏水性氨基酸的N端，若其N端连接的是Pro则水解会被抑制，水解速度和氨基酸疏水性大致成正比。

专一性水解：

1. BrCN水解Met的C端

2. NH2OH（羟胺）较为专一的断裂Asn-Gly，对Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂。

3. NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）专一裂解-Cys-，产率高于90%。

N末端氨基酸测定方法：

1. Sanger法

2. Edman法

3. DNS-Cl

4. 酶降解法

C末端氨基酸测定方法：

1. 肼解法

2. 酶降解法

3. 硼氢化锂法

二硫键的断裂：在8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。

二硫键的切割与保护：

1. 过甲酸（performic acid）氧化，巯基被氧化为-CH2SO3H；

2. 还原+氧化；

3. 亚硫酸（Sulfitolysis）分解。

Cys 的不稳定性：

1. Cys受空气氧化而形成Cys-Cys。

2. Cys和Cys-Cys会发生交换反应。

3. 分析氨基酸组成时，Cys容易受修饰而不利于定量。

4. S-S键使蛋白酶难于作用。Edman反应中不能形成稳定的PTH-AA。

5. 多条肽链以S-S键相连，拥有两个以上N末端，无法用Edman法测序。

N端的测定方法：

1. Sanger法

2. Edman法

3. Dansyl chloride/Edman法

4. 酶降解法-氨肽酶法

酶解法末端测序：外切蛋白水解酶（exo-peptidase）将肽链的氨基酸从N端（氨肽酶，aminopeptidase）或C端（羧肽酶，carboxypeptidase）一个接一个游离出来，在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序。

氨肽酶（aminopeptidase）法：优点是可连续测定N-端多个AA；条件温和；缺点是酶反应通常是可逆的，水解不彻底，易因酶对末端AA的反应性不同而导致判断失误。

C端的测定方法：

1. 肼法（Hydrazine）

2. 3H标记法

3. 酶降解法-羧肽酶法

4. PFPA和PFPAA法

二硫键位置测定：一般采用胃蛋白酶水解+对角线电泳方法。胃蛋白酶的作用pH有利于防止二硫键发生交换。