综述 | 临床微生物学实验室中的mNGS：走向成熟之路

来源：微生态 译者：陈佩佩
原文：https://mp.weixin.qq.com/s/lQni2FMTqK6faKb6auVmsw

综述信息：

综述框架：

摘要：

新一代宏基因组测序（mNGS）正在越来越多地应用于临床实验室进行无差别的微生物培养与独立诊断。它能否成为下一个常规的病原体鉴定工具成为人们关注的话题。本文回顾了这项传染病诊断新技术的应用现状，并讨论了将mNGS转化为常规诊断试验的可行性。自2008年以来，来自20多个国家的大量研究揭示了mNGS在诊断未确诊传染病方面的实用性。mNGS在直接从临床样本中识别罕见、新颖、难以检测和共感染的病原体方面表现良好，通过对抗生素耐药基因进行测序，在预测耐药性方面显示出巨大潜力，为指导治疗方案和改善抗生素管理提供了新的诊断证据。许多医生认为mNGS是解决临床感染问题的最后手段。尽管在临床实验室常规实施mNGS之前，仍存在一些障碍，如工作流程验证、质量控制、方法标准化和数据解释，但这些障碍是暂时的，可以通过快速发展的技术加以克服。随着更有效的工作流程、更低的成本和周转时间以及简化的解释标准，mNGS将在临床实践中被广泛接受。总的来说，mNGS正在改变临床微生物学实验室的面貌，为了确保它在临床诊断中得到正确的应用，医生和微生物学家都应该彻底了解这种方法的威力和局限性。

1、背景介绍

传染病仍然是全世界医疗保健的重大负担。在过去20年中，每年约有1500万人死于传染病。新出现和重新出现的致命病原体，如MERS-CoV、西尼罗河病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒和拉萨病毒以及人类免疫缺陷病毒（HIV）等经典病原体的传播和多药耐药性的病原体（multi-drug-resistant Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae,Mycobacterium tuberculosis, etc.），使得传染病的精确诊断和有效治疗带来的日益严峻的挑战。

目前，临床实验室对病原体的鉴定主要依赖于传统的培养依赖性诊断技术（例如培养、核酸扩增试验、免疫分析，以及16S rRNA基因测序和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）等较新技术。这些方法有明显的优势和局限性，在处理复杂的感染时，它们往往会暴露出诸如繁琐、耗时和有限的诊断准确性等弱点，从而导致延误或错过诊断。据报道， 40%的肠道感染，50%的血流感染（BSI），以及超过50%的中枢神经系统感染的传染病的病因仍不清楚。这些未确诊的病例迫使医生开出经验性的广谱抗生素治疗方案，这将大大增加出现多重耐药细菌的风险，并增加严重感染患者死亡率的可能性。

下一代测序技术（mNGS）为传染病的诊断打开了另一扇窗户。许多NGS仪器，如Illumina MiSeq/NextSeq/HiSeq和Life Technologies Ion PGM/Proton，允许在一次测序过程中从许多单个细菌/样本中获得数据（不超过2.5天）。例如，NextSeq平台可以对每次运行的400个基因组进行测序，并在1.2天内产生约4亿次的读取。NGS技术的这些优势正在改变临床医生思考如何治疗未确诊病例的方式，从传统医学转向基于基因组的诊断。

mNGS是一种无偏见分析患者样本中微生物和宿主基因含量的有前途的技术，正迅速从研究转向临床实验室。大量已发表的病例报告和临床研究表明，mNGS已成功地应用于脑脊液、呼吸道分泌物、粪便、尿液、血液和组织等几十种样品。它在诊断复杂和严重的感染如血液感染、呼吸道感染、骨关节感染、脑炎等方面显示出极大的优势（图1A）。此外，mNGS似乎有希望用于应变水平分型，抗菌药物耐药性（AMR）检测，毒力分析，以及检测到的病原体的系统发育相关性。越来越多的医生认识到这是解决感染问题的最后手段。mNGS是否会成为临床实验室下一个常规技术的问题正在变得越来越普遍。在这篇综述中，将首先简要介绍宏基因组学的发展，然后总结mNGS在临床微生物学中的应用现状，并进一步讨论该技术用于常规诊断的可行性。

图1 通过调研2019年前发表的108项研究，确定了mNGS在传染病诊断中的当前实施情况。（A） mNGS分析已被用于识别身体不同部位各种传染病的病原体；（B）这些研究广泛分布于23个国家；（C）半数以上（62.63%）的研究基于Illumina平台；（D）mNGS研究的数量逐年呈指数增长，且大多数这些研究主要用于实时和概念验证诊断目的；（E）mNGS研究在各种传染病中的分布。

2、宏基因组学概述

宏基因组测序是利用测序技术对微生物基因组（称为元基因组）混合物进行的培养独立分析。元基因组学最早的应用是研究不同环境中的不可培养微生物，如酸性矿井排水、马尾藻、土壤，甚至沉没的鲸鱼骨骼。最新进展，如优化和验证的工作流程，缩短周转时间（TAT）（平均48小时），敏感性提高和定制生物信息学，推动了基因组学领域进入病原体鉴定的临床实践。在临床微生物学领域，宏基因组测序被称为临床宏基因组学（CMg），有着前所未有的能力从单个临床样本中并行捕获任何类型微生物的总核酸。据我们所知，2008年3月报告了第一次使用CMg进行病原体鉴定。作者在一系列致命的移植相关疾病中发现了一种新的沙那病毒。在过去的5年里（从2013年开始），尽管大多数CMg测试是基于第二代测序（大规模并行短读测序），但基于第三代测序（单分子、实时测序）的测试已经出现，并开始用于病原体鉴定。鉴于实时测序的强大优势（如便携式系统、快速测序等），预测它在未来的临床应用中必将占有很大的市场份额。为了帮助读者理解这一强大技术的发展（图2），本文绘制了宏基因组学进展的简要时间表。欲了解更多信息，建议读者参考其他介绍元基因组学历史的出版物。

图2 宏基因组学发展简史。自2008年首次将mNGS用于人类传染病病原鉴定以来，宏基因组方法在人类传染病中的应用发展迅速。

3、mNGS的临床应用

3.1 临床应用概述与前景

在2008年3月发表的一项回顾性研究中，Palacios等人利用无偏的宏基因组学方法，在三名接受同一器官捐赠者器官的患者的样本中鉴定出一种新的沙砾病毒。结果随后通过培养、PCR、免疫组化和血清学分析进行验证。本研究首次表明，mNGS作为一种新的工具，可以方便地鉴别急慢性传染病的致病微生物。随后，这项技术逐渐应用于临床，特别是2015年以后，mNGS报告数量呈指数级增长（图1B）。到目前为止（2018年11月），来自23个国家的100多份病例报告或临床表现研究表明了MNG在协助传染病诊断方面的实用性。美国和中国在将该技术应用于临床实践方面贡献最大（图1C），大多数分析（约63%）在Illumina测序平台上进行（图1D）。mNGS已用于9种以上人类功能系统感染性疾病的病原体鉴定（图1A），主要用于中枢神经系统、呼吸系统和循环系统感染（图1E）。有趣的是，在中枢神经系统感染中，高达78.1%（25/32）的研究是为了实时诊断。另外，在循环系统感染的研究中，实时应用的比例也比较高（35.7%，5/14）。相比之下，呼吸系统感染的研究数量仅次于中枢神经系统感染，但只有21.4%（6/28）用于实时诊断，大多数研究（53.6%，15/28）是概念验证分析。这一研究分布表明，目前临床上使用的mNGS更有可能用于无菌样本，如脑脊液和血液。然而，在具有复杂背景的样本中（如尿液、大便、痰液），许多尝试仍停留在验证阶段。

重要的是，一系列研究表明，与传统的基于培养基的方法相比，mNGS检测可以产生更好的性能。例如，迄今为止最大的一项队列研究（包括511个临床样本）表明，mNGS的检测灵敏度（50.7%）高于培养（35.2%），并且受先前抗生素暴露的影响较小，与传统方法相比，在免疫功能低下的mNGS患者中检出临床相关微生物的比例显著高于传统方法（分别为36/101和11/101，p<0.001）。此外，与超声培养相比，宏基因组测序显示出更高的物种水平敏感性88%（95%可信区间（CI），77-94%），物种水平特异性80%（95%CI，71-88%）用于假体感染病原体的鉴定。这些发现，再加上用户友好、快速测序技术的日益普及，有助于将mNGS转化为传染病的常规诊断工具。

此外，mNGS还提供了一些新的检测思路。例如，应用mNGS法对3例不能耐受或拒绝支气管镜检查的Pneumocystis pneumonia（PCP）患者进行外周血标本中的Pneumocystis jirovecii鉴定。Mai等人首次报道尿液在mNGS检测中对诊断黄病毒性脑炎有用。这些发现告诉我们，mNGS可以被认为是一种替代性的非侵入性工具，用于分析那些无法忍受侵入性操作的威胁生命的感染性病例中容易获得的样本（例如血液、尿液等）。然而，在现阶段，需要更多的临床经验来支持这些新的检测理念的实施。例如，在利用mNGS鉴定病原体时，有必要澄清哪些传染病和这些疾病的哪个阶段适合收集易于获取的样本。通常但不是绝对的，当血液丰富的组织（如肺、肝等）发生局部感染或侵袭性感染（如侵袭性真菌病）时，病原体更容易进入循环系统。此时，采集的外周血样有助于检测病原体。更重要的是，确定用于预防感染的药物会干扰病原体的检测率，这对于做出准确的诊断同样重要。其他方面，如用什么样的检测指标来鉴别被检测的微生物是否是真正的局部病变（如侵袭性肺炎、脑炎等）病原体，以及如何设置药物判定水平等，也需要临床经验的积累。

总之，上述文献综述表明，尽管mNGS仍在走向成熟的道路上，但它正在逐渐被认可，并且在不久的将来可以应用于更广泛的领域。

3.2 病原菌的检测

目前，mNGS检测在临床上处于最前沿，通常是在通过显微镜、培养基、血清学或一系列样本的分子检查未能确定病因的情况下。换言之，只有当病人住院数周并接受昂贵的侵入性检测时，才考虑进行mNGS检测。然而，这些延迟应用的mNGS实际上在检测难治性感染患者的以下药物方面表现良好；这项技术有可能成为快速可靠的病原体鉴定手段。

3.2.1 罕见病原体

2014年，Wilson等人报告一例罕见的慢性神经肽螺旋体病，在急性发作后持续数月。传统的脑脊液培养、血清学检测、PCR等方法均未能检测出引起感染的罪魁祸首。当在脑脊液样本中进行mNGS分析时，识别出了特异于Leptospira santarosai的序列，随后的血清学检测和PCR证实了Leptospirasantarosai的感染。2015年，临床医生通过mNGS分析脑脊液样本，诊断出另一例致命性脑膜脑炎病例，并迅速发现了一种罕见的传染源——Balamuthia mandrillaris。2018年，几项研究报告成功利用mNGS管道诊断罕见的传染病病原。研究报告了在一名16岁脑炎男孩的尿液中诊断出Japanese encephalitis virus病毒，异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）患者沙眼衣原体感染，Naegleria fowleri相关原发性Spirometra erinaceieuropaei 脑膜脑炎，比利时一名老年患者的西尼罗河病毒感染和一名11岁女孩的呼吸道感染。所有这些研究都说明了基于MNG的方法识别罕见传染病病因的能力。

3.2.2 新型病原体

新的包括新的病原体和新的因果关系，病原体和疾病之间的mNGS检测。Piantadosi等人最近报道了Powassanvirus的快速识别，一种新出现的蜱传黄病毒，由脑炎患者的mNGS检测。Ai等人描述2017年7月，一名女性患者因伪狂犬病病毒（PRV）感染性眼内炎。结果表明，PRV可能通过直接接触猪的污染物而感染人类。使用mNGS，Wylie等人发现痤疮丙酸杆菌是皮肤正常菌群的一部分，是慢性脑膜炎的病因。临床样本中的痤疮特异性序列比对照组多，基因组覆盖率高，对痤疮的治疗效果也支持他们的结论。在其他典型病例中，唾液支原体被鉴定为一种新的PJI病原体，一种新的variegated squirrel 1 bornavirus病毒（VSBV-1）被鉴定为致命性人类脑炎的起源。此外，在过去三年中，微生物如人类pegivirus、Psychrobacter sp.310、Basidiobolusmeristosporus、人鼻病毒B91和Cache valley病毒也被报道为引起特定传染病的新原因。这些报告大大增加了我们对微生物感染的了解。需要新的诊断方法，如mNGS，以扩大传染病病原体的检测范围。

3.2.3 难以检测的病原体

临床上常见难检出病原体，常规检测难以检出。例如，肝结核（hepaticTB）是一种缺乏特定临床表现，临床上极易误诊的疾病。Ai等人首次报道了用mNGS法快速诊断结核分枝杆菌引起的局部肝结核，从而确定了mNGS检测在不明原因肝损害诊断中的应用前景。Pneumocystis pneumonia (PCP) 是一种严重的感染病，通常发生在免疫缺陷患者。zhang等最近的一项研究，结果表明，与传统方法相比，mNGS方法具有更高的PCP检出率。在其他报告中，mNGS还显示出强大的能力来诊断非典型临床表现的病例，例如由猪带绦虫引起的神经囊虫病（NCC），以及布鲁氏菌引起的神经布鲁氏菌病。

3.3.5 排除传染病病因的能力

临床上，在疾病评估中确认感染和排除感染同样重要。理论上，鉴于泛病原体检测的特性（即能够同时检测样本中存在的DNA和RNA病毒、细菌、真菌和寄生虫），mNGS在排除感染方面似乎比有偏见的普通检测更有说服力的方式。如前所述，许多研究表明，mNGS的诊断性能（包括负预测值（NPV））优于常用的方法，这表明这项新的临床试验也有排除感染的能力。在一项前瞻性试点研究中，Salzberg等人用mNGS检测10例疑似中枢神经系统感染患者的脑或脊髓活检中的潜在病原体。在5名患者中发现阴性或非特异性mNGS，因此确定他们没有活动性感染。这一结论得到了随后的病理证实和有效的类固醇治疗的支持。可靠的阴性mNGS结果可能有助于支持不存在感染的发现，这将有助于减少医生对活动性感染的担忧。随着mNGS工作流程的进一步优化和临床诊断测试准确性的提高，该技术将在排除感染方面发挥更大的作用。

3.3.6 耐药性评估

及时有效的药物治疗是抵抗感染的关键。传统的常规抗生素敏感性试验（AST）或抗生素耐药基因（ARG）检测方法通常是对分离的病原菌进行的。这些方法耗费时间，而且进一步忽视了无法培养的细菌。mNGS具有对病原体基因组（部分或全长）进行测序的能力，因此在整个细菌群落中鉴定ARGs具有极大的吸引力。2016年，一项研究发现，被忽视的精氨酸可以被mNGS检测到。一项概念验证研究表明，在单微生物和多微生物样本中，mNGS检测可预测94.1%和76.5%的骨关节感染（BJI）患者的抗生素敏感性。Grumaz等人建立了完整的mNGS工作流程来诊断败血症患者的菌血症。重要的是，他们毫不含糊地确定了一些读码，与两个万古霉素耐药基因（万古霉素和万古霉素）100%一致，这两个基因来自万古霉素耐药屎肠球菌（VRE）菌株，经微生物检测证实，从而证明了mNGS用于检测血浆cfDNA中抗生素耐药标记的适用性。Kirstahler等人通过整体分析鉴定眼内炎患者的耐药谱分离株基因组序列（WGS）组装和宏基因组组装。新上市的实时宏基因组学（Oxford Nanopore测序和PacBio-SMRT测序）似乎在检测已知精氨酸是否存在方面更有优势。

如引言部分所述，mNGS分析也有助于进化追踪、菌株鉴定和毒力预测，甚至有助于监测疾病进展和治疗效果。然而，在目前的临床实践中，在大多数情况下，只有当常规检测失败时才考虑应用mNGS。一项研究表明，在检测常见的细菌感染时，mNGS并没有表现出更大的优势。因此，促进这项技术的日常使用是首要任务。我们必须清楚地认识到，mNGS是一项正在积极发展中的复杂技术，受到许多因素（如成本、TAT、方法标准化、数据分析工具等）的影响。最近的工作流程改进已经解决了许多这些障碍，随着进一步的努力，这种新方法将在更多的诊断实验室中被常规接受。

4、mNGS用于常规诊断的可行性探讨

4.1 质量保证

微生物学实验室中使用的典型mNGS工作流程涉及多个过程（图3），这些过程都在不断优化和发展。由于在撰写本文时还没有FDA批准的mNGS传染病诊断方法，一些实验室将样本发送给第三方（商业）供应商进行测试，而其他实验室则构建自己的工作流程来检测病原体。然而，这些实验室开发的工作流程高度个性化，只适用于特定的感染类型或样本类型。许多关键的步骤彼此不同，包括样品制备、试剂选择、测序过程和最终的生物信息学管道（参考数据库和统计分析）。这些工作流程缺乏方法标准化和验证，阻碍了评估不同实验室产生的结果可变性的能力，导致最终结果的不确定性。因此，在匆忙实施mNGS测试之前，必须进行广泛的验证以确保结果准确且可重复。2017年，Schlaberg、Chiu等人首次提出了在临床实验室验证宏基因组病原体检测测试的示例解决方案。他们强调了验证实验室协议、数据分析算法、参考数据库以及建立严格的质量控制（QC）指标的必要性。2018年5月，Chiu实验室根据临床实验室改进修正案（CLIA）的要求，成功开发并验证了一种用于从脑脊液中综合诊断脑膜炎和脑炎病原体的mNGS分析方法。分析性能指标包括检测限、精密度、准确度、干扰影响和稳定性等。此已验证工作流的详细信息显示在网站上(https://nextgendiagnostics.ucsf.edu/technology/)并报道过。此外，临床mNGS检测的其他样本类型和感染的验证工作正在进行中。这些实践将使mNGS成为临床上可用的病原体检测手段，并为其他实验室验证其性能提供了一个可行的参考模型。对于任何实验室，必须仔细考虑制定监管要求（即，遵守CLIA、ISO15189、CAP、欧洲指令98/79/EC的规定或其他）完全适用于临床基因组学工作流程的验证；细节在别处讨论。更重要的是，阳性和阴性对照必须在验证阶段后的整个过程中与临床样本一起运行。

图3 临床实验室mNGS工作流程概述。工作流程包括两个部分：（1）湿实验室管道（从样本采集到测序）和（2）干实验室管道（从数据分析到最终结果解释）。目前，一个完整的mNGS分析可以在24小时内完成，成本约3000元人民币。

4.2TAT和成本

目前大多数mNGS平台能够在24-72小时（平均48小时）内完成从采样到最终结果的分析。第三代测序技术甚至可以将TAT缩短到几个小时。大大缩短了细菌在临床和实验室间的采样时间对临床标本的病原鉴定。然而，最大的障碍是没有合适的方法来显著缩短AST的体外培养时间。如前所述，mNGS有能力识别所检测病原体的ARG，一旦技术成熟，应大大缩短药物敏感结果的报告时间。在临床病毒学中，特异性PCR是目前检测病毒感染的金标准，可以在12小时内完成对已知病毒的鉴定。目前的无偏mNGS分析无法达到这个速度。然而，随着快速测序技术的发展（如简化的工作流程、快速的库准备和测序、简化和快速的数据分析等），特别是随着单分子实时测序技术的成熟，可以合理预测，在未来几年内，增强型鸟枪基因组学的诊断速度和准确性将大大提高。我们期待着临床微生物学检测步入几个小时的时代。

在传染病诊断中使用mNGS是另一个值得关注的问题。一项研究提到，一次测序实验花费大约250美元。在中国，目前每个样本的成本为人民币3000元（约合400元），高于任何一种常用方法。应该记住，许多传染病不能用传统技术进行诊断，这使得使用这些工具进行病原体筛查有时成本更低。相比之下，mNGS可以在一次测试中无偏见地识别所有潜在的病原体，并能提供更及时的健康相关信息，这对患者康复非常重要。

4.3 测序结果的分析与讨论

随着测序技术的发展，最重要的瓶颈将不再是测序，而是专业的分析员分析数据，做出合理准确的解释。首先，考虑到无偏和超敏感的特性，mNGS分析可以产生大量与多种微生物相匹配的序列。如何区分致病病原体（正常微生物和环境污染物）是一项挑战。第二，在一些培养阳性的样本中，mNGS结果可能是阴性的（即假阴性问题）。阴性的原因包括：（1）在某些感染中，病原体载量低于mNGS的检测限；例如脑脊液样本中某些代表性微生物的检出限在0.16-313cfu/ml之间。因此，mNGS分析可能会漏掉浓度很低的病原体。在病原体负荷较低的情况下，微生物核酸富集或宿主核酸耗竭是必要的。（2）在核酸提取过程中，一些病原体（如真菌）的刚性细胞壁很难被裂解，这可能导致核酸产率较低；以及（3）一些菌株在预处理过程中易受裂解试剂的DNA降解。第三，读得最多的微生物并不总是致病菌。

由于缺乏统一的解释标准，医生对mNGS的结果持谨慎态度。在实践中，根据以下线索或证据，mNGS发现的微生物通常部分或全部被视为致病因子：（i）覆盖率（物种水平）明显大于任何其他微生物或对照材料中的覆盖率，或映射读数位于微生物列表的顶部。（ii）传统技术如培养、血清学检测、PCR、Sanger测序和组织病理学证实了这一结果。（iii）在治疗过程中，序列号或读数或病原体负荷显著减少和（iv）经靶向抗菌药物治疗后患者病情好转。

4.4 其他方面

除上述三个方面外，其他过程（如取样、核酸提取和富集、测序和数据存储等）也需要进一步优化；它们已在别处讨论过。在图4中，我们总结了临床实验室有效实施mNGS技术的关键点（图4A），并简要描述必要的质量管理（测试验证、质量控制和能力验证），以帮助确保测试结果的准确性（图4B）。

图4 临床微生物学实验室有效实施mNGS的要点和质量保证。（A） 在mNGS实验中有许多关键步骤需要注意，因为它们会影响最终结果。本研究将mNGS工作流程分为三个阶段（分析前阶段、分析阶段和分析后阶段）。（B） 质量管理措施（测试验证、质量控制程序和能力验证）有助于确保在临床实验室环境中保持准确的测试结果。缩写：SOP：标准操作规程；RMs：标准物质；NA：核酸。

5、总结

在许多研究和临床环境中，mNGS检测泛病原体的潜力已得到证实。mNGS在不需要先验知识的情况下可以很好地检测罕见的、新的和共感染的病原体，并且在耐药性预测方面具有优势，从而为危重病或免疫缺陷患者的难诊断感染提供了新的诊断线索。虽然在样品处理、工作流程建立、分析管道、监管要求和结果解释等方面存在不足，但这些都是暂时的，将通过快速发展的技术加以克服。此外，随着更有效的工作流程、更低的成本和TAT以及简化的解释标准，mNGS将被临床医生、微生物学家和患者广泛接受。因此，随着测序技术的进一步发展，以及更多的实践经验和评估，预计在未来5-10年内，mNGS检测将成为临床实验室的常规技术。