2022-07-02 RNA-seq处理流程

对于RNA-seq实验与分析流程是三天前开始学习的，简单记录一下。

RNA-seq 实验可以捕获全部RNA（不区分类型），也可以根据成熟转录本尾部特异性polyA 尾巴特异性选择mRNA。

普通的RNA-seq是不能区分链的，也就是说我们不能知道转录本来自正链还是负链，但是通过dUTP的掺入，可用特定的酶将反转录合成的第二条cDNA链降解，这样就知道转录本来自于哪一条链，后续比对到参考基因的时要用特定的参数rna-strandness。

数据处理的过程主要包括质控——映射到参考基因组——组装定量——后续分析（如：差异表达）

1.质控我是用fastp 主要去接头污染和低质量的片段，碱基。

2.质控后用fastqc看一眼，各项指标是否满足向下分析的要求

3.mapping  我使用的是hisat2 

（1）用hisat2要提前准备好index，自己建立index比较费时我选择在hisat2官网直接下载

Download | HISAT2 (daehwankimlab.github.io)

（2）index建立过程是需要gtf文件的，这个要留意hisat2官网使用的gtf版本，因为后续组装的时候需要用到gtf文件，要使两者保持一致，如果后续使用ballgown 要加上-dta参数

Table Browser (ucsc.edu)

GENCODE - Human Release 19 (gencodegenes.org)

4.对数据进行定量

（1）stringtie

stringtie  -G ../reference/gencode.vM25.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf -o SRR{i}.gtf -l SRR${i} SRR${i}.q10.sort.bam

ls -l SRR*.gtf | awk '{print $9}' > sample_assembly_gtf_list.txt

stringtie --merge -p 8 -o stringtie_merged.gtf -G ../reference/gencode.vM25.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf sample_assembly_gtf_list.txt

gffcompare -r ../reference/gencode.vM25.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf  -o gffcompare stringtie_merged.gtf

(2)featureCounts

featureCounts -p -t exon -g gene_id -M -T 8 -a ../reference/gencode.vM25.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf -o all.featurecounts.txt ./*sort.bam

awk -F '\t' '{print $1,$7,$8,$9,$10,$11,$12}' OFS='\t' all.featurecounts.txt > all_fcount.matrix.txt

5.差异表达分析

使用R包ballgown和DEseq2都可以