文献学习086--TREM2hi原位巨噬细胞通过维持心肌稳态保护脓毒心

今年二月的一篇NM

脓毒症（sepsis）affects approximately 49 million individuals and causes over 11 million fatalities worldwide annually。其病情恶化快，并常常引发脓毒症心肌病（sepsis-induced cardiomyopathy，SICM）。出现SICM的患者表现为EF值降低，死亡率增高。值得注意的是，SICM存在短暂的可逆的心功能失代偿，提示septic stress后心脏稳态得到恢复。但是脓毒血症病程中心功能恢复的机制尚不明确。

心脏免疫细胞在组织损伤后组织稳态的调节中起到重要作用。在心脏中，巨噬细胞是最主要的免疫细胞，尤其是组织驻留巨噬细胞（tissue resident macrophages，TRMs）在数量和功能上都是健康心脏的重要组成部分，对感染做出早期反应。但在脓毒症期间，尤其是SICM的发病过程中，这些细胞是否发挥着什么作用尚不明确。

该研究揭示了脓毒症心功能障碍的关键免疫细胞亚群，发现TREM2hi的心脏原位巨噬细胞具有维持心肌细胞线粒体稳态，救治脓毒症心肌病的潜在前景。

1. Single-cell characterization of immune cells in septic heart

为了探究脓毒血症病程中reversible myocardial dysfunction的机制，作者通过盲肠结扎穿孔诱导SICM，并对不同时间点的心功能和心脏损伤标志物进行了检测。结果显示心功能在3天最差，随后逐渐恢复。心脏损伤标志物的趋势相同。
These results indicate that the dynamic changes of cardiac function during sepsis progression are consistent with the inflammatory environment of cardiac tissue.

随后作者分离了上述四个时间点SICM小鼠心脏的CD45免疫细胞，进行了单细胞测序。（14个小鼠，4个样本）一共得到29543个细胞，注释得到6种免疫细胞，其中巨噬细胞是占比最多的免疫细胞。在造模早期，心脏中性粒和单核细胞增多，巨噬细胞轻度下降，在后期逐渐恢复。

2. Mac1 is associated with restoration of cardiac function

由于单核巨噬细胞占比最多，作者对单核巨噬细胞进行了二次聚类，得到8个细胞群。
比例分析结果显示Mac1和Mac2是正常心脏的主要细胞群。在造模后3d，Mac3和Mac4显著增加。随着7d和21d心功能逐渐恢复，Mac1的比例也增加。使用CD163 和 RETNLA 作为Mac1的marker进行流式检测得到一致的结果。
此外，随着疾病进展，Mac1的绝对数和EF正相关，和cTnI负相关。
Taken together, these data reveal a distinct CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺CD163⁺RETNLA⁺ Mac1 subcluster that is associated with the restoration of cardiac dysfunction after septic stress.

巨噬细胞的注释依据

3. Developmental trajectory and lineage tracing of Mac1 subset

为了探究Mac1和其他单核巨噬细胞的关系，作者进行了monocle分析。结果显示Mac1存在于轨迹起始，而Mon1, Mon2 和 DC 存在于轨迹终点。Mac2存在于轨迹后部，Mac3和Mac1一样存在于轨迹起始。

为了验证前面的轨迹分析结果，作者使用了tamoxifen-inducible Cx3cr1^{CreERT2–IRES–YFP}鼠与Rosa26-stop-tdTomato reporter mice (termed Cx3cr1^CreERT2:Rosa26^tdTom)鼠杂交来trackSICM中的Mac1。

Cx3cr1标记组织原位巨噬

作者使用流式检测了心脏中F4/80^-Ly6c⁺单核、非Mac1和Mac1中Tomato阳性的细胞比例，发现正常心脏75.1%的非Mac1和99.6%的Mac1是Tomato阳性的，在CLP后，Tomato阳性的非Mac1减少，但仍有超过95%的Mac1是Tomato阳性的。提示Mac1是组织原位巨噬细胞来源。
同样的流式结果也显示Tomato阳性的Mac1的绝对数造模后3d减少，7天又增多。
作者还对Tomato阳性的Mac1进行了增殖检测，结果显示造模3d细胞增殖增加，7天下降。
These data suggest that CD163⁺RETNLA⁺ Mac1 cells are self-renewing CRMs, independent of replenishment from circulating monocytes and display proliferative bursts during sepsis.

4. TREM2 is essential for Mac1 cells remodeling during SICM

随后作者对Mac1进行了功能富集，发现富集到多条吞噬相关通路(a)。而且吞噬相关基因Trem2在Mac1高表达(b)。免疫荧光显示Trem2和Mac1的marker CD163存在共定位(c)。流式结果也显示Mac1比非Mac1表达更高的Trem2(d)。
随后作者对Trem2-/-的小鼠和control进行了CLP，之后对心脏免疫细胞进行了单细胞测序。结果显示CLP7天后Mac1没有恢复，其他细胞比例则不受影响(e, f)。流式结果与单细胞一致(g)。此外，Trem2敲除鼠的Mac1增殖功能减弱。这些结果表明 TREM2 是 Mac1 亚群的标志物，并且对于脓毒症心脏中 Mac1 细胞的重塑至关重要。

5. Sepsis induces extracellular exopher accumulation in heart

心肌细胞使用exophers排出功能失调的线粒体，exophers平均直径为 3.5±0.1μm，平均体积为 31.0±2.5μm314，类似于秀丽隐杆线虫神经元中描述的结构。 心脏巨噬细胞通过清除这些亚细胞颗粒和有缺陷的线粒体来维持心脏稳态（来自20年一篇cell¹）。
作者的数据表明，脓毒症心脏中巨噬细胞的稳态被破坏了。 作者推测，而这种稳态失衡可能会损害心肌细胞衍生的受损线粒体的清除。

因此，作者首先将 αMHC^Cre 小鼠与 Rosa26^TdTom 小鼠杂交，得到心肌细胞特异性心肌细胞红色荧光小鼠 (Card^RED mice)。作者在脓毒症 Card^RED 小鼠心脏中观察到一些亚细胞颗粒(exophers)的蓄积，并与线粒体蛋白 Tom20 在细胞外存在共定位（5a b）。

透射电镜 (TEM) 结果显示，CLP 后 3d，心肌细胞外周游离线粒体显著累积。

此外，对 exophers 进行流式纯化后，作者观察到心脏 exophers 对线粒体探针 MitoTracker Green 和 MitoNIR 呈阳性(c d)，还显示膜电位降低和对超极化剂的反应丧失(e)。

这些结果显示脓毒症导致心肌细胞排出的功能失调的线粒体在心脏细胞外空间积聚。

6. TREM2^hi Mac1 cells eliminate cardiac exophers during sepsis

由于游离线粒体和线粒体 DNA (mtDNA) 可引起心脏损伤，清除含有心肌细胞衍生线粒体的 exopher 对于维持心脏稳态和恢复心脏功能非常重要。
接下来，作者探讨了脓毒症心脏中功能失调的线粒体的清除机制。 TEM 图像显示，与心肌细胞相邻的一些细胞显示出与巨噬细胞相似的大小和形态。 这些巨噬细胞伸展出假足，包围着脓毒症心肌细胞周围含有线粒体的囊泡（c）。 一致地，共聚焦和三维 (3D) 图像显示在脓毒症 Card^RED 小鼠心脏中， TREM2⁺ 细胞吞噬含有线粒体的exophers（红色, d）

为了量化 TREM2^hi Mac1 (CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺CD163⁺) 细胞的吞噬活性，作者通过将 mtD2^Flox/Flox 与 αMHC^Cre/+ 小鼠杂交构建了心肌细胞特异性线粒体报告小鼠 (MitoCard) 。confocal结果显示心肌细胞衍生的线粒体位于 TREM2⁺ 巨噬细胞中（e）。 流式分析还表明，TREM2^hi Mac1 细胞在 SICM 期间包含了更多的心肌细胞衍生线粒体(Extended Data Fig. 6h)。 此外，作者对脓毒症 WT 小鼠的心脏进行 TUNEL 染色，发现脓毒症后第 3 天 TUNEL⁺cTnI⁺ 细胞在总细胞中的百分比（TUNEL+cTnI+/DAPI）非常低（约 1 %) (Extended Data Fig. 6i)。 这些结果排除了 TREM2hi 细胞吞噬了来自脓毒症心脏的凋亡物质的可能性。

为了阐明 Mac1 细胞中心肌细胞衍生线粒体的命运，作者用溶酶体标记物 Lamp1 对 TREM2 和脓毒症 MitoCard 小鼠的心脏切片进行免疫染色，并观察到 TREM2⁺ 细胞中的 mt-Dendra2 信号部分定位于 LAMP1⁺ 溶酶体（f)。 接下来，作者包装了AAV9-Tnnt2-mt-Keima 病毒，并进行心肌内注射，以确保 Keima 蛋白在心肌细胞线粒体（mt-Keima）中的特异性表达。 免疫荧光染色显示大量的 mt-Keima⁺ 颗粒集中在 TREM2⁺ 巨噬细胞中（g）。 Keima 对 pH 敏感，其激发光谱的峰值可以从较短（绿色，在中性环境中）转变成较长（红色，在酸性环境中）波长。 视频和 3D 图像显示，TREM2⁺ 巨噬细胞中的 mt-Keima 在注射了 AAV9-Tnnt2-mt-Keima 病毒的脓毒症 WT 小鼠的心脏中同时存在绿色和红色荧光信号（g），这表明Mac1 细胞吞噬的线粒体可能被输送到酸性溶酶体环境。
这些数据表明 TREM2^hi Mac1 细胞在消除心肌细胞衍生的功能失调线粒体方面具有强大的活性。

7. Trem2 deficiency impairs defective mitochondria removal

单细胞数据分析显示，与 WT 细胞相比，Trem2^-/- 小鼠中巨噬细胞的大多数内吞基因特征如 Wwp1、Ccr5、Cd36、Eps15、Cltc、Mrc1、Ccl24、Dab2 和 Folr2 表达下降（Extended Data Fig. 7b,c）。

随后作者检查了 TREM2 对巨噬细胞摄取心肌细胞衍生线粒体的影响。 作者分别对 WT 和 Trem2 ^-/- 小鼠进行了AAV9-Tnnt2-mt-Keima 病毒的心肌内注射。 结果显示Trem2^-/- 脓毒症小鼠的 CD163⁺ 巨噬细胞对心肌细胞线粒体和 Keima 的摄取减少（Fig 5h）。 接下来，作者将来自 WT 或 Trem2^-/- 小鼠的骨髓细胞移植到 Card^RED 受体小鼠中，8 周后，进行了 CLP 手术。 作者发现在 CLP 后 7 d时，WT →⟩Card^RED CD163⁺RETNLA⁺ Mac1 细胞比 Trem2^−/−→CardRED CD163⁺RETNLA⁺ Mac1 细胞清除了更多的心肌细胞衍生物质（Fig 5i）。 一致地，免疫荧光显示更多的心肌细胞衍生线粒体积聚在Trem2^−/−→CardRED 嵌合体的心脏中（Fig 5j）。 此外，Trem2 缺陷小鼠在 CLP 后 7d 表现出游离线粒体在心肌细胞外间隙中的严重积累，但这在稳定状态下的 Trem2 缺陷小鼠中未发现(Extended Data Fig. 7e)。这些数据表明 TREM2 促进了脓毒症心脏中 Mac1 细胞对受损线粒体的清除。

8. Trem2 deficiency exacerbates cardiac dysfunction in sepsis

为了确定 TREM2^hi Mac1 细胞在 SICM 中的重要性，作者比较了 CLP 后 WT 和 Trem2 ^-/- 小鼠的存活率、心脏收缩功能、心脏损伤标志物和炎症情况。 结果显示Trem2^-/- 脓毒症小鼠的死亡率显着增加（a）。超声也显示与 WT 对照相比，Trem2 ^-/- 小鼠的心功能更差，表现为较低的 EF、FS和CO，尤其是在 CLP 后 7 d和 21 d（b)。 在 Trem2^-/- 脓毒症小鼠中，血清中 cTnI 和 LDH 的浓度以及心脏组织中 Anp 和 Bnp 的mRNA 水平均增加（c）。 此外，Trem2 缺陷显著升高了 CLP 后促炎介质的 mRNA 水平。

骨髓来源的巨噬细胞有助于嵌合小鼠中常驻的小胶质细胞池。 分别用来自 WT 或 Trem2^-/- 小鼠（CD45.2 背景）的骨髓细胞移植受照射的受体（CD45.1 背景）。 流式细胞术测定表明，在骨髓移植 (BMT) 后 8 周，经照射的嵌合体中 Mac1 细胞的重建效率超过 90%。 流式细胞术和实时 PCR 结果表明，Trem2^−/−→WT 嵌合体 (Trem2^−/−Ch) 在心脏巨噬细胞中的 TREM2 蛋白水平和心脏组织中的 Trem2 mRNA 水平低于 WT→⟩WT 嵌合体 (Trem2^+/+Ch) ）。 BMT 八周后，对嵌合小鼠进行 CLP。 作者发现巨噬细胞中 Trem2 特异性缺陷加剧了脓毒症后的心脏功能障碍、心肌损伤和心脏炎症（图 6d–j）。 此外，Trem2^-/-Ch 嵌合体表现出加重的线粒体损伤（图 6k）、降低的 ATP 水平（图 6l）和增加的乳酸水平（图 6m）。 这些结果表明 TREM2 对于 Mac1 在脓毒症后保护心脏功能至关重要。

9. Transplantation of TREM2hi Mac1 cells protects SICM

最后，作者试图检查 Mac1 细胞治疗是否可以保护脓毒症后的心脏功能。 在 CLP 后立即将来自 CD45.1 小鼠心脏的分选的 TREM2hi Mac1 和非 Mac1 细胞分别移植到 CD45.2 小鼠的心包空间中。 对照动物心包内注射相同体积的基质胶（MG）（图7a）。 流式细胞术分析表明，移植的 Mac1 和非 Mac1 细胞在 CLP 后可以在受体心脏中存活并持续存在至少 7 d。 与注射 MG 的小鼠相比，在检查的时间点，Mac1 细胞注射小鼠心脏中 Mac1 细胞占总 CD45+ 细胞的比例显着增加。 类似地，与注射 MG 的小鼠相比，在检查的时间点，非 Mac1 注射小鼠的心脏中非 Mac1 细胞在总 CD45+ 细胞中的比例也有所增加。 此外，Mac1 和非 Mac1 细胞用 CellTracker Orange (CMTMR) 标记，然后在 CLP 后立即转移到心包腔中。 3d 后，组织学测定表明移植细胞广泛分布在心肌中。 此外，作者将 CMTMR 标记的 Mac1 细胞心包内转移到 MitoCard 小鼠中。 三天后，共聚焦和 3D 图像显示注射的细胞吞噬了心肌细胞衍生的线粒体。 这些数据共同表明，移植的 Mac1 细胞可以进入心肌，在受体小鼠的心脏中存活至少 7d，并吞噬心肌细胞来源的线粒体。

与心包内移植的非 Mac1 细胞或 MG 组相比，移植有 TREM2hi Mac1 细胞的脓毒症小鼠的心脏显示出显着增强的心脏功能（图 7b-e）。 一致地，TREM2hi Mac1 细胞移植改善了心脏损伤（图 7f–i）、炎症（图 7j、k）、线粒体损伤（图 7l）、ATP 水平升高（图 7m）和乳酸水平降低（图 7m、7n)。

接下来，从 WT 或 Trem2−/− 小鼠的心脏中分离出 WT Mac1 细胞和 Trem2−/− Mac1 细胞，并在 CLP 后立即心包内移植（每只小鼠 2××10 5 个细胞）到 Trem2−/− 小鼠的心脏。 3 天和 7 天后，超声心动图显示，与注射 Trem2-/- Mac1 细胞或 MG 组的 Trem2-/- 小鼠相比，移植 WT Mac1 细胞可显着增强脓毒症小鼠的心脏功能。 一致地，WT Mac1 细胞移植改善了心脏损伤、炎症、增强的 ATP 水平和降低的乳酸水平。 综上所述，这些结果表明，施用 TREM2hi Mac1 细胞可能是预防和挽救脓毒症心功能障碍的潜在治疗方法。

参考文献：

1. Nicolás-Ávila, J. A. et al. A network of macrophages supports mitochondrial homeostasis in the heart. Cell 183, 94–109 (2020).