从DNA甲基化的角度为急性心梗的早期临床诊断和治疗靶点提供潜在的生物标志物

Integrative analysis of DNA methylation and gene expression reveals key molecular signatures in acute myocardial infarction

DNA甲基化和基因表达的综合分析揭示了急性心肌梗塞的关键分子特征

发表期刊：Clin Epigenetics

发表日期： 2022 Mar 27

doi:10.1186/s13148-022-01267-x

一、背景

        急性心肌梗死(AMI)由于发病快、致死率高，一直是各类心脏病中最致命的疾病之一，造成了大量的医疗支出。AMI的表现是脆弱的斑块破裂进入冠状动脉，继而出现凝固和血管堵塞，最终导致大量心肌细胞死亡。AMI后的病理过程包括早期的急性炎症期和后期的修复和重塑期。了解AMI早期的分子变化有利于疾病的诊断和干预。

        有研究通过对患者全血 RNA 样本的生物信息学分析，确定了用于早期诊断 AMI 的极具潜力的生物分子标志物。然而，现有研究中可用的信息对于AMI的临床有效和及时干预仍然有限。表观遗传学数据尤其是 DNA 甲基化，是了解疾病分子机制的一种很有前途的方法。然而迄今为止，关于AMI早期心肌组织中DNA甲基化的改变和功能知之甚少。

二、材料与方法

1.数据来源

动物模型：特定的无病原体C57BL/6小鼠（雄性，8周）；小鼠被随机分为不同的实验组（Sham、AMI 10分钟、1小时、6小时、24小时和72小时），每组有3只小鼠

2.实验流程

(1)MeDIP-seq数据生成、数据处理和分析

(2)RNA-seq数据分析和功能注释：原始数据被存放在GEO（GSE153494）；按照HISAT2、StringTie和Ballgown的工作流程分析差异表达基因（DEGs）；进行KEGG通路富集分析，研究可能参与AMI发生和进展的基因功能和信号通路

(3)相关性分析：研究DEGs和DMPs之间的关联，采用Pearson相关分析

(4)基于新一代测序的亚硫酸氢盐测序PCR、定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR)、细胞培养和处理、Western blots

三、实验结果

1.AMI进展过程中DNA甲基化修饰的变化

        作者通过结扎冠状动脉左前降支近端建立AMI小鼠模型，并选择六个时间点（Sham、AMI 10min、1h、6h、24h和72h，n = 18）来评估AMI过程中的分子变化（图1A）。在每个时间点获取AMI小鼠的梗死左心室组织进行RNA-seq和MeDIP-seq。

        为了探索DNA甲基化修饰与AMI进展之间的关系，使用从MeDIP-seq测序数据中获得的峰值位置信息来分析峰值、基因和基因功能元件（启动子、5'UTR、CDS、3' UTR、Intron和TTR）。对CpG岛进行了注释，以检测基因组元件上富含甲基化的分布区域（图S1）。发现在不同的时间点，基因组上峰的整体分布没有太大的变化，但应该是一些微小的差异导致了基因转录水平的巨大变化。为了获取与AMI发展相关的甲基化位点，作者以sham组为对照，在AMI后的不同时间点进行差异DNA甲基化分析（|log 2 FC|> 1；P值<0.05）。如图1B所示，在AMI后10分钟、1小时、6小时、24小时和72小时分别获得了18814、18614、23587、26018和33788个差异甲基化位置（DMPs）。并且分别有7951（42%）、9108（49%）、1212（51%）、12707（49%）、13631（52%）个低甲基化位置的DMPs（图1B）。从DMPs的时间分布来看，发现随着AMI逐渐发展，DMPs的数量和区别也越来越大。图1C显示了在这5个时间点同时出现的前50个DMPs。

图S1 基因组元件上富含甲基化的分布区域

        为了直观地了解DMPs在不同时间点的整体表达模式，分别对不同区域的所有DMPs进行了分层聚类分析。启动子和外显子区域显示出类似的聚类结果，10分钟组和sham组之间的甲基化表达模式没有明显差异，而在1小时、6小时、24小时出现明显差异，并在72小时再次发生变化。Intron和3'UTR区域显示，6h与1h和24h聚成一个单独的类别，表明这两个甲基化区域并不随时间单调变化。此外，远端基因间在不同时间点之间有更多独立的DNA甲基化模式，而5'UTR区域的聚类作用并不明显。

        大量的研究表明，启动子区域的DNA甲基化会影响基因的表达，所以作者选择了启动子区域的CpG岛进行进一步分析，在设定的时间点分别识别到了2638、2477、2979、3704和5881个DMPs（图1D）。

图1    AMI模型在一系列时间点的全基因组DNA甲基化分析

2.差异表达的基因在 AMI 早期阶段变得明显

        为了确定AMI发展过程中的转录组改变，使用RNA-Seq检测相同样本组中的mRNA表达。对转录组图谱进行了主成分分析（PCA），结果表明6h组、24h组和72h组与其他组有明显区别，而较早期的时间点（10min、1h）似乎与sham组接近。10min AMI组与对照组相比，有123个差异表达的基因（DEGs），其中89个基因是上调的，而其他34个下调（图2A）。后面的的四个时间点与对照组相比，分别有135、731、1419和2779个DEGs，大多数DEGs的表达量增加（图2B-E）。结果表明，AMI后DEGs的数量和转录表达的差异程度随时间推移逐渐增加。值得注意的是，DEGs的剧烈变化从AMI后6小时开始出现，而前几个阶段（10分钟，1小时）的变化相对较温和。

图2    转录组数据的差异表达基因（DEGs）分析

3.AMI不同时间点通路的动态变化

        接下来，使用David基因功能注释在线工具对每个时间点筛选的DEGs进行通路富集分析。在AMI的早期阶段（10min至1h），少数功能通路被富集，包括MAPK信号通路、TNF信号通路和PI3K-Akt信号通路等。在6h AMI时，富集通路结构出现了明显变化，不仅增加了许多新的通路，如Jak-STAT和脂肪细胞因子信号通路，而且早期富集的通路中涉及的DEGs范围明显扩大（图3）。这表明6h AMI是AMI发展过程中的一个重要转化期。最显著的功能通路包括TNF信号通路、MAPK信号通路和细胞因子受体相互作用，这些通路主要与炎症和免疫及细胞过程有关。从24h到72h AMI阶段，代谢途径（氨基酸糖和核苷酸糖代谢，内质网蛋白质加工）和疾病途径（肥厚型心肌病，扩张型心肌病）开始加入到富集通路中。

图3    6h AMI时差异表达基因的KEGG通路富集分析

        为了确定完整的转录组数据集的时间特征，使用Mfuzz对6个时间点的10765个基因进行了聚类分析，将所有基因分为6个簇（图4A）。簇2和簇5中的基因都随着时间的推移呈单调上升，但簇5在6h前上升，而簇2在24h时上升，而簇3中的基因总体上逐渐下调。然后，在每个簇内搜索富集的KEGG通路，绘制热图（图4B），发现KEGG通路是针对一个或多个集群的。簇3中富集的一些途径是独特的，如 "氧化磷酸化 "和 "心肌收缩"，表明具有较高的时间特异性和下降趋势。相反，簇2和簇5中有更多的重叠途径，如"剪接体"、"内吞作用 "和 "Fc gamma R-介导的吞噬作用"，表明随着时间的推移有上升的趋势。

图4    对6个时间点的转录组数据集进行聚类分析，并在每个聚类中进行KEGG途径富集分析

4.鉴定AMI进展中受DMPs调控的DEGs

        启动子的高甲基化抑制下游基因的表达，而低甲基化会增加表达。作者通过以下标准预测AMI过程中受DMPs调控的DEGs：(1)mRNA的差异表达，(2)启动子的差异甲基化，(3)通过Pearson相关分析，mRNA和甲基化的水平呈负相关。在AMI后的五个时间点（10min、1h、6h、24h和72h），分别发现了4、9、40、26和183个符合DNA甲基化负调控机制的基因（图5A）。图5B显示了在AMI后DNA甲基化带来的大规模表型变化开始发生的6小时，受DMPs调节的40个DEGs。此外，发现已识别的基因中的大多数（40个基因中的33个）在转录水平上高度表达，启动子甲基化修饰较低，而其余一小部分基因则下调，甲基化水平较高。

图5    启动子区域的DNA甲基化水平与mRNA表达的相关性分析

5.候选基因DNA甲基化修饰的功能验证

        基于上述结果，作者对可能参与AMI重要生物学过程的候选基因进行了DNA甲基化的表达和功能验证。首先，手动选择了32个被预测为受DNA甲基化调控并参与重要KEGG途径的基因，通过qRT-PCR验证其mRNA表达。如图6A-E所示，Spi1、Map3k14、Ncf4等在MI后6小时上调，Ptpn6、Plcg2、Edem1等在24小时上调，Cyba、Itgb5、Col6a1等在72小时上调。

图6    候选基因的表达验证

        然后，结合qRT-PCR和MeDIP-Seq数据的结果，排除了那些在基因表达变化后发生DNA甲基化显著变化的基因，然后使用基于下一代测序的BSP验证了上述32个基因中剩余21个基因启动子的DNA甲基化状态。结果显示，10个基因的启动子甲基化趋势与预测结果一致（图6F-J和图S5）。Ncf4、Map3k14和Spi1的启动子区域的甲基化水平在MI后6小时下降，Ptpn6、Csf1r和Itga11在24小时下降，Ddost、Cyba、Itgb5、Col6a1在72小时下降。

图S5 通过亚硫酸盐测序PCR验证候选基因的启动子甲基化表达

        此外，为了解决这10个基因的转录水平是否直接受到心肌细胞DNA甲基化的影响，在体外对H9c2细胞的整个DNA甲基化进行了抑制。如图7所示，1μM地西他滨抑制了H9c2细胞中甲基转移酶1（Dnmt1）的表达，与未处理组相比，去甲基化后Ptpn6、Csf1r、Col6a1、Cyba、Map3k14的mRNA水平上调。说明这5个候选基因在心肌细胞中的表达受到了DNA甲基化的调节。Ptpn6、Csf1r、Col6a1、Cyba和Map3k14参与了MI的发病机制，因此认为它们启动子的甲基化改变在AMI中发挥重要作用。

图7    体外DNA甲基化调控基因的验证

四、结论

        研究通过全基因组甲基化测序分析了 AMI 早期心肌组织中 DNA 甲基化的变化，并通过与转录组的综合分析揭示了其对基因表达的影响。通过DNA甲基化调控确认了参与AMI过程的5个候选基因，为AMI的早期临床诊断和治疗靶点提供了有希望的基于甲基化的生物标志物。