单细胞实战(二) CellRanger使用前注意事项

刘小泽写于19.5.4-5.5
上次拿到了sra原始数据，接下来就要使用10X官方的软件cell ranger进行操作了，但使用前需要注意几个地方

将SRA转为fastq

我们使用fastq-dump这款软件，它是sra-tool中的一个工具，使用conda安装即可

conda install -c bioconda sra-tools

关于这个软件，参数设置一般比较简单(虽然帮助文档写的不是那么好理解)

wkd=/home/project/single-cell/MCC
cd $wkd/raw/P2586-4
cat SRR_Acc_List-2586-4.txt |while read i
do
time fastq-dump --gzip --split-3 -A $i ${i}.sra && echo "** ${i}.sra to fastq done **"
done

其中主要使用了三个参数：

--gzip将生成的结果fastq文件进行压缩
--split-3其实有点复杂：首先它是分割的意思，-3实际上指的是分成3个文件，它诞生的时间比较早，是在1000 Genome的Phase1阶段产生的。

https://www.biostars.org/p/186741/

如果结果发现只有一个文件，说明数据不是双端(第三个文件太大会覆盖前两个)；

如果结果有两个文件，说明是双端文件并且数据质量比较高(没有低质量的reads或者长度小于20bp的reads)；

如果结果有三个文件，说明是双端文件，但是有的数据质量不高，存在trim的结果，第三个文件的名字一般是：.fastq，而且文件也不大，基本可以忽略
-A指定输出的文件名

如果使用上面的参数--split-3，结果只有一个fq文件

利用cell ranger软件分析，一般需要两个输入文件，其中一个是测序reads，另一个是UMI+Barcode文件，那么只生成一个文件是不够的，因此可以换个参数

使用另外一个参数--split-files来替代--split-3 ，就可以生成三个文件，其中第一个文件的所有序列都是8bp，第二个文件都是26bp，第三个文件都是91bp，初步判断，第三个文件是测序reads

image-20190920110138765

这里可以对比下这两个参数输出的数据

但是前两个呢？哪一个是UMI+Barcode？

如何解释生成的这三个fastq文件

单细胞转录组数据和普通的bulk转录组还是不太一样，bulk结果一般就是R1、R2，很容易区分；10X单细胞数据比较特殊，它的测序文库中包括index、barcode、UMI和测序reads。

文章使用的是10X Genomics 3' Chromium v2.0 平台，那么就看一下它的帮助手册（https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/1CnKSfa7taoQwIEe0WaA4m/8635b2c9ee86c022e731b6fb2e13fed2/CG000080_10x_Technical_Note_Base_Composition_SC3_v2_RevB.pdf ）

先大概了解一下10X文库组成：

其中Read2：98那里的星号表示这个长度不是固定的，可以调整，比如文章中患者P2586-4的Read2长度就是98，而患者9245-3的Read2长度是91

然后看看测序时每个run cycle做了什么事：

利用illumina边合成变测序（sequencing by synthesis ,SBS），每一个cycle都是一个碱基，因此用cycle数可以表示测序长度

首先，1-26个cycle就是测序得到了26个碱基，先是16个Barcode碱基，然后是10个UMI碱基；

然后，27-34这8个cycle得到了8个碱基，就是i7的sample index；

最后35-132个cycle得到了98个碱基，就是转录本reads

看下Read1、i7 index、Read2的碱基分布：

可以看到转录本read前端有20多bp质量是存在波动的，因为5’端的前几个碱基为随机引物序列，存在一定的偏好性

另外，index和barcode有什么区别，为什么用两个fq文件进行区分？

找到10X官方给出的一个解答：https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/115002777072-How-do-I-demultiplex-by-sample-index-and-barcode-

i7 sample index（library barcode）是加到Illumina测序接头上的，保证多个测序文库可以在同一个flow-cell上或者同一个lane上进行混合测序(multiplexed)。当然可以自己指定index，但更多情况下会使用10X公司提供的index序列(bundled index sets)，针对不同项目使用的index也是不同的。不过共性就是：96孔板的每个孔中都加入了4种不同的index oligos混合(详见：https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/218168503-What-oligos-are-in-my-sample-index-)。

image-20190920110219008

它的作用就是在CellRanger的mkfastq 功能中体现出来的，它自动识别样本index名称（例如：SA-GA-A1），将具有相同4种oligo的fq文件组合在一起，表示同一个样本。它保证了一个测序lane上可以容纳多个样本

然后回过头，又看了看GEO的数据记录，发现的确记录了index信息，

但是作者没有上传最原始的BCL文件，因此无法体验mkfastq的功能，但是官网有测试数据。这里了解大体的拆分流程就好
10X Barcode（Cell barcode） 是10X特有的，用来区分GEMs，也就是对细胞做了一个标记。一般在拆分混养测序数据（demultiplexing）这个过程后进行操作，当然这也很符合原文的操作
在实验建库的过程中，barcoding过程(也就是GEM生成的过程)是早于indexing过程(它是PCR的最后阶段)，但是生信分析过程把这两个顺序颠倒过来了，我们需要先根据样本index，利用mkfastq 将reads进行demultiplex，分到各自的测序文库中去，然后对每个文库再处理barcodes信息

UMI的作用呢？

它是为处理PCR 扩增偏差而生

首先，不管是bulk RNA还是scRNA，都需要进行PCR扩增，但是不可避免有一些转录本会被扩增太多次，超过了真实表达量。当起始文库大小很小时（比如单细胞数据），就需要更多次的PCR过程，这个次数越多，引入的误差就越大

UMI就是Unique Molecular Identifier，由4-10个随机核苷酸组成，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA随机连上一个UMI，根据PCR结果可以计数不同的UMI，最终统计mRNA的数量。

UMI有几个要求：

不能是均聚物，如AAAAAAAAAA
不能有N碱基
不能包含碱基质量低于10的碱基

综上所述：raw fastq中包含以下信息

Library Barcode (Sample Index) - Used to pool multiple samples on one sequencing lane

Cell Barcode (10x Barcode) – Used to identify the cell the read came from

Unique Molecular Index (UMI) – Used to identify reads that arise during PCR replication

Sequencing Reads – Used to identify the gene a read came from

那么这三个文件的名称需要修改吗？

我认为是需要修改的，因为命名太模糊，不容易指定文件进行下游分析。
然后看到官网给出的解答：https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/2.0/using/fastq-input#wrongname ，也的确说需要修改

那么怎么改？

肯定要批量处理，就利用下载SRA的SRR ID好了

# 比如，将原来的SRR7692286_1.fastq.gz改成SRR7692286_S1_L001_I1_001.fastq.gz
# 依次类推，将原来_2的改成R1，将_3改成R2
cat  SRR_Acc_List-9245-3.txt | while read i ;do (mv ${i}_1*.gz ${i}_S1_L001_I1_001.fastq.gz;mv ${i}_2*.gz ${i}_S1_L001_R1_001.fastq.gz;mv ${i}_3*.gz ${i}_S1_L001_R2_001.fastq.gz);done

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CellRanger走起(二) 使用前注意事项