CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(7)验证敲除--WB

前期记录

先确定目标基因
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(1)
然后对目的基因进行背景调查
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(2)磨刀不误砍柴工
设计sgRNA及引物
CRISPR-Cas9(三)--sgRNA设计好之后
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(3)sgRNA及引物设计
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(4)构建sgRNA+Cas9载体
转染验证
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(5)293FT细胞转染验证 and trouble shooting
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(6)正式转染+单克隆细胞筛选

遇到的困难:WB检测无表达

以下是我的基本流程:

1. 买好抗体

2. 确定该细胞有该蛋白表达

3. 查阅文献,确定WB检测之前不需要特殊处理

4. 使用阳性样本验证抗体是否可用

5. 大胆做实验---失败

不是没有在验证表达上吃过亏,上次吃亏我已经吸取到教训,在WB验证之前,仔细查阅了同样的细胞系的该蛋白的表达情况,并且在RNA-seq数据中也发现了是有一定表达量的,至少有PNAS,NC级别的文章验证过该蛋白在该细胞中的表达,并且不需要任何预先处理,所以放心的去做了WB。但是打脸真的是啪啪的。首先,每个课题组的情况都不一样,其次,所用的试剂耗材未必相同,接着预处理未必一样,还有就是别人的结果我们不一定能重复出来,因此在遇到蛋白水平无法检测的时候该怎么办。

首先,回去再次确认文献信息,确认蛋白表达,并查阅新的文献--没查到特殊要求。

使用免疫荧光检查表达。因为有些蛋白在常规情况下表达量非常低,这时候免疫荧光比WB能更好的检测低表达样本。

先刺激蛋白表达,再总蛋白验证

说干就干。

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