CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（7）验证敲除--WB

前期记录

先确定目标基因
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（1）
然后对目的基因进行背景调查
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（2）磨刀不误砍柴工
设计sgRNA及引物
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（3）sgRNA及引物设计
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（4）构建sgRNA+Cas9载体
转染验证
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（5）293FT细胞转染验证 and trouble shooting
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（6）正式转染+单克隆细胞筛选

遇到的困难：WB检测无表达

以下是我的基本流程：

1. 买好抗体

2. 确定该细胞有该蛋白表达

3. 查阅文献，确定WB检测之前不需要特殊处理

4. 使用阳性样本验证抗体是否可用

5. 大胆做实验---失败

不是没有在验证表达上吃过亏，上次吃亏我已经吸取到教训，在WB验证之前，仔细查阅了同样的细胞系的该蛋白的表达情况，并且在RNA-seq数据中也发现了是有一定表达量的，至少有PNAS，NC级别的文章验证过该蛋白在该细胞中的表达，并且不需要任何预先处理，所以放心的去做了WB。但是打脸真的是啪啪的。首先，每个课题组的情况都不一样，其次，所用的试剂耗材未必相同，接着预处理未必一样，还有就是别人的结果我们不一定能重复出来，因此在遇到蛋白水平无法检测的时候该怎么办。

首先，回去再次确认文献信息，确认蛋白表达，并查阅新的文献--没查到特殊要求。

使用免疫荧光检查表达。因为有些蛋白在常规情况下表达量非常低，这时候免疫荧光比WB能更好的检测低表达样本。

先刺激蛋白表达，再总蛋白验证

说干就干。