摘自《小球藻高附加值生物活性物质“小球藻热水提取物”的研究现状与展望》
作者：庄秀园1，黄英明2，张道敬1，陶黎明3，李元广1
1 华东理工大学 生物反应器工程重点实验室，上海
2 中国生物技术发展中心，北京
3 华东理工大学 药学院，上海
2015，31（1）：24-42刊登于《生物工程学报》
（绿先优）小球藻是一种食用历史久、营养丰富的微藻功能食品，由于小球藻本身是一种营养丰富又安全的食物，在免疫调节其等许多方面具有功效，近年来已成为畅销全球的功能食品，其中蛋白核小球藻已于2012年被我国批准为新资源食品。
小球藻中所含的最引人注目的是一种被称为小球藻生长因子CGF或者”绿藻精“的热水提取物 (CE)，是小球藻有别于其他微藻的主要生物活性物质，在促进生长、调节免疫等方面具有良好功效，且市场售价高。但迄今，有关CGF的认识尚不清晰，尚未见CGF方面的系统评述。本文对近年来CGF的活性研究状况进行了系统的文献调查与梳理，综述了小球藻生长因子CGF在增强免疫、抑制肿瘤、改善代谢综合征、清除自由基、抵御紫外损伤、螯合重金属以及保肝护肠等多个方面的功效。
关于“CGF”的早期报道
（1）“CGF”的发展历程
直径3−12 μm的小球藻已经在地球上生存了约几十亿年。自从1890年荷兰微生物学家Beijerinck发现并命名了小球藻，世界各国逐渐展开了各种针对小球藻的研究。由于二战后人口膨胀，20世纪中叶，德、美、日等国家将高蛋白含量的小球藻作为缓解世界粮食紧张问题的“超级食品”进行研究。
1957年日本政府于东京设立日本绿藻研究所，Fujimaki教授在加热后的小球藻细胞悬液中提取到了一种水溶性生物活性物质，成为“CGF”发展历程中重要的里程碑。由于该物质能够显著促进细胞生长，并使乳酸菌呈4倍增殖，因此被命名为“小球藻生长因子--CGF”。研究发现“CGF”中含有蛋白质、多糖、核苷酸、多肽、维生素和微量元素等多种物质，对高血糖、高血压以及重金属中毒患者的身体状况具有显著改善作用。
（2）CGF的惊人功效
在Fujimaki教授发现“CGF”后，关于小球藻及“CGF”的生物活性研究在日本如火如荼地开展了起来，研究者通过大量基础和临床研究，发现小球藻和“CGF”对人体具有多种显著的调节功能。时至今日，小球藻系列功能食品在日本数以千计的健康食品中排名一直居于前列。
早期研究中CGF功能和实例列举如下：
1) 促进生长：
1965年Okuda等发现“CGF”能够促进四膜虫生长，随后他们又报道了“CGF”对酵母以及溶藻弧菌生长的促进作用；而Takada等发现“CGF”能提高酵母在高盐环境中的生存能力 (1984年)；Nakashima发现“CGF”能够使乳酸菌等有益菌成倍生长。
2) 增强免疫：
1962年Takuma报道了一例牛奶过敏婴儿的案例，使用小球藻作为非乳蛋白源可以医治婴儿脸部和颈部的湿疹；1972年Kojima等发现“CGF”中的糖蛋白能够增强免疫力，并促进大鼠网状系统对细菌吞噬的作用。
3) 解毒：
1975年Ichimura使用小球藻治疗受镉污染影响的日本“痛痛病”患者，发现食用小球藻能够有效排除人体内的重金属；同年Ichimura用小球藻治疗我国台湾地区砷中毒的“乌脚病”患者，食用小球藻3个月后，患者病况明显改善。
4) 降血糖、血压：
1977年台北医学院生化科研究室发现小球藻对糖尿病花鼠有降血糖作用；1978年日本近畿大学医学研究小组Okamoto等发现小球藻碱性提取物及“CGF”中腺苷或低聚肽有良好的降血压效果。
近年来的研究试验列举如下：
（一）CGF的免疫调节活性：
1、以Hasegawa为代表的日本研究团队将10% (W/V) 的藻粉在100 ℃煮沸20min制备CGF。据称经口给予这种CGF能够增强小鼠骨髓细胞和脾细胞数目，并有效杀灭通过腹腔注射进小鼠体内的大肠杆菌；增强正常小鼠和艾滋小鼠对单增李斯特菌感染的抵御能力，通过提高众多细胞因子的表达水平增强小鼠细胞免疫功能，并通过产生干扰素-γ (γ-IFN) 加强T辅助细胞1 (Th1) 型免疫应答。
2、巴西学者Queiroz等使用Hasegawa提供的CGF进行研究，发现CGF能够增强小鼠骨髓祖细胞的集落刺激活性；同时能够恢复单增李斯特菌感染鼠的骨髓粒-巨噬祖细胞数目，并增强其集落刺激活性；改善铅诱导的骨髓抑制，提高单增李斯特菌致死剂量下小鼠的存活率；恢复铅处理小鼠骨髓细胞结构和细胞因子的产生能力。
3、韩士群等采用酶解法制备了CGF，发现CGF可以明显增强二硝基氟苯引起的小鼠迟发型超敏反应，恢复造血功能，并增强单核-巨噬细胞的吞噬功能。
4、2010年韩国学者An构建了“蛋白-能量营养不良”小鼠模型，以研究CGF的免疫调节作用。结果CGF喂饲组血清中总蛋白、清蛋白、葡萄糖和γ-IFN等参数上升，脾和浅表淋巴结免疫细胞数目增加。
5、2013年韩国Bae等发现CGF能够阻断大鼠腹膜肥大细胞对胞外Ca2+的吸收，阻止细胞脱落和组胺释放；同时CGF对变态反应具有抑制作用，在CGF治疗下，卵清蛋白免疫的BALB/c小鼠，其γ-IFN和白细胞介素-12 (IL-12) 水平上升，免疫球蛋白E (IgE) 的过剩表达得到抑制。
6、小球藻多聚糖是CGF中颇受关注的成分。2003年Guzmán等以角叉菜胶诱导大鼠足肿胀模型，发现从超声破碎的小球藻C. stigmatophora悬液中制备的多糖具有抗炎活性，而体内外迟发型超敏反应和噬菌活性检测表明，该多糖具有免疫抑制作用。
7、2005年施瑛发现蛋白核小球藻多糖剂量依赖性地调节小鼠的免疫功能，
8、加拿大Kralovec等将CGF经透析、层析处理后得到一种含有25%蛋白质的蛋白聚糖，将该蛋白聚糖用于卵清蛋白诱导的小鼠过敏性气道炎模型，结果在卵清蛋白致敏和刺激过程中，该蛋白聚糖能够显著降低小鼠在体气道嗜酸性细胞、嗜中性粒细胞渗透。
9、中国台湾Hsu等称小球藻水溶性多聚糖能够增加脂多糖诱导的C57BL/6J小鼠肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和IL-1β血清分泌。
10、Ewart等将藻粉于80℃水提1h后，取分子质量大于12 kDa的上清液制备CGF，结果该CGF能刺激正常人外周血单核细胞引起一种Th1式细胞因子应答和强烈的抗炎调节细胞因子应答，细胞因子IL-10水平显著增加，同时Th1相关的γ- IFN和TNF-α强烈激活，而Th2的典型因子IL-4和IL-13减少，与Hasegawa等动物水平的研究结果一致。
11、2005年Kralovec等用CGF中含有25%蛋白质的蛋白聚糖组分处理小鼠骨髓源肥大细胞18h，结果该组分显著抑制三硝基-牛血清白蛋白诱导的IL-5的产生，并抑制人脐带血源肥大细胞中IgG依赖性的粒-巨噬细胞集落刺激因子形成。2007年，他们发现CGF中能够有效刺激小鼠B细胞增殖并活化巨噬细胞的多数免疫刺激活性物质存在于多聚糖/蛋白复合物中，且分子质量一般大于100 kDa，但该团队至今未公布该复合物的具体组成。
12、2010年韩国An等检测了CGF对人T淋巴细胞株MOLT-4和原代脾细胞中细胞因子生成的影响，结果CGF作用下两者的IL-2和IL-4生成增加，但对γ-IFN的生成无明显影响。
13、Hsu等在2010年发表的论文中较为深入地报道了蛋白核小球藻多聚糖体外免疫调节信号转换的分子机制。该文研究了小球藻水溶性多聚糖对巨噬细胞J774A.1中细胞因子产生、人白细胞抗原表达和共刺激分子表达的影响，证明多聚糖通过Toll样受体4 (TLR4) 介导的蛋白激酶信号通路引起巨噬细胞IL-1β分泌，从而起到了免疫调节的作用。
14、2013年王凌等报道，小球藻粗多糖能够有效增加巨噬细胞Raw264.7的增殖能力和吞噬能力，并提高细胞外NO水平。
（二）CGF的抗肿瘤活性性：
在日本学者进行的大量动物水平和临床研究中，小球藻和CGF均具有显著地抑制肿瘤的作用。
1、1984年日本Tanaka所在的研究团队将CGF注射到小鼠肿瘤区域或肿瘤附近的皮下组织，通过测量肿瘤直径大小来判断抑癌能力，结果发现无论预防还是治疗，注射CGF后肿瘤的生长均受到显著抑制。在无胸腺裸鼠以及注射了巨噬细胞阻断剂的小鼠中，CGF的抑癌作用受到抑制或削弱，表明小球藻增加小鼠抗癌能力需要T淋巴细胞和巨噬细胞的参与。1985年他们继续研究CGF的抗肿瘤活性，发现接种同源性Meth-A肿瘤细胞的BALB/c小鼠，在腹腔注射CGF后存活时间明显延长。而正常小鼠注射CGF24 h后，其富含分叶核白细胞的腹膜流出细胞对小鼠具有抗肿瘤作用，且这种作用在T细胞或巨噬细胞缺失的状态下仍然完好无损。2001年，他们又发现在肿瘤内注射CGF对肿瘤自发的和实验诱导的转移均具有显著抑制作用，而皮下注射还能预防抗癌药物引起的骨髓抑制和内部感染。
2、马来西亚Yusof研究团队采用Hasegawa的方法制备CGF，2006年他们报道了马来西亚小球藻提取物和日本小球藻提取物对HepG2的抑制作用，前者IC50为1.6 mg/mL，后者基本上没有抑制作用，且正常肝细胞WRL68的生长也受到了严重抑制 (IC50约1.7 mg/mL)[59]；2010年，他们在前期研究浓度的基础上进一步研究了CGF对HepG2细胞的抗增殖和凋亡诱导作用，称CGF剂量依赖性地减少HepG2的活细胞数量 (IC50仍为1.6 mg/mL)，加剧DNA损伤，提高细胞凋亡率，并推测CGF可能通过增加凋亡相关基因P53、Bax和caspas-3的表达，降低Bcl-2的表达而诱导凋亡级联信号，进而引起DNA损伤和细胞凋亡。
3、汪炬等以动物移植性肿瘤肉瘤S180、肝癌HCA腹水瘤为模型，发现CGF能够在体内、体外有效抑制上述两种肿瘤，与环磷酰胺也有良好的联合作用。
4、1996年Hasegawa研究团队发现，从小球藻培养液中提取的ARS-2是一个分子质量63.1 kDa的糖蛋白，其中蛋白质组分是其具有抗肿瘤活性的关键。2002年他们研究了ARS-2对TLR2或TLR4功能基因敲除鼠产生IL-12 p40亚基的影响，发现前者的p40水平受到显著抑制，而后者反而升高，推测水溶性小球藻糖蛋白的抗肿瘤活性至少部分涉及TLR2。
5、2008年魏文志以体外筛选化学预防剂的转基因细胞模型为工具，发现中分子质量约63.7kDa的糖蛋白具有肿瘤预防作用，其最佳浓度在 200ug/mL，且存在剂量效应关系。
（三）CGF对代谢综合征的改善作用：
1、2011年谭成玉等使用索氏提取器从10%藻粉悬液中制备CGF，发现该CGF对α-葡萄糖苷酶的活性具有一定的抑制作用，其IC50为3.14 mg/mL。
2、2004年Hidaka等对大鼠进行了卵巢切除以模拟妇女绝经后的生理状态，发现卵巢切除组大鼠在自由饮用日本MIYABI有限公司的“Miyabi Chlorella 900 CGF solution”7周后，其甘油三酯等血脂水平趋于正常，体重增加也得到了有效控制，认为饮食添加CGF可能有益于绝经后妇女体重的控制和脂质代谢的平衡。
3、韩国Ko等使用碱性蛋白酶对海洋椭圆小球藻的蛋白质进行水解，得到分子质量467.2 Da，氨基酸序列为Val-Glu-Gly-Tyr的片段，该片段对血管紧张素转换酶的IC50为128.4 μmol/L。
4、在临床试验方面，2001年Merchant等发现饮食中添加小球藻能够改善高血压患者的症状。他们给受试者每日服用SUN CHLORELLA公司的固体藻片和“Wakasa Gold”饮料2个月后，检测了患者的血压和血脂水平，发现小球藻日常饮食补充能够降低血压和血清胆固醇水平。
（四）CGF的抗氧化活性：
1、2009年日本Kitada等通过改变提取温度和压力，研究产物的得率和活性，发现随着提取压力增大、温度提高，CGF得率得到提高，其抗氧化性也随温度的升高而增强。
2、马来西亚Makpol等在研究过氧化氢 (H2O2) 引起的人成纤维细胞DNA损伤时发现，无论是预防还是治疗，采用Hasegawa方法制备的CGF均能降低这种损伤，且对年轻或年老成纤维细胞的氧化损伤具有不同的保护机制：CGF对年轻来源的成纤维细胞具有生物保护作用，能使其免遭自由基攻击；而对年老来源的成纤维细胞更多的是生物修复作用。
3、魏文志从CGF中分离得到了相对分子质量为63.7 kDa的糖蛋白，其清除羟自由基 (˙OH) 能力高于维生素C，但还原能力、清除超氧阴离子自由基 (O2̅˙)、DPPH自由基 (DPPH˙) 和烷基自由基的能力均低于维生素C。
4、2012年韩国Ko等对海洋椭圆小球藻蛋白进行酶解，通过连续色谱层析分离，制备了一种氨基酸序列为Leu-Asn-Gly-Asp-Val-Trp (702.2 Da) 的新型抗氧化肽，该抗氧化肽能够清除H2O2、DPPH˙和˙OH，IC50分别为0.02、0.92、1.42 mmol/L，并增强自由基引发剂AAPH损伤下正常猴肾细胞的存活率，减少AAPH引起的细胞凋亡和坏死率。
（五）CGF的抗紫外 (UV) 损伤活性：
1、1998年Hsu等使用凝胶迁移率分析从DEAE纤维素层析和肝素亲和层析分离得到CGF组分，发现CGF中分子质量约为72、80和90 kDa的3个多肽对UV诱导的DNA损伤具有识别结合活性CGF。
2、2008年Shih等将10%成熟鲜小球藻的藻粉于100 ℃提取30 min，得到的CGF对皮肤纤维原细胞具有潜在保护作用，能使UVB诱导下培养液中表达增加的基质金属蛋白酶-1 (MMP-1) 水平有效降低，并使表达下降的弹性蛋白和前胶原蛋白mRNA水平正常化。
3、2011年Chen等将皮肤原纤维细胞经UVB照射后，用CGF中分子质量430−1 350 kDa的小球藻肽进行处理，发现该小球藻肽能够通过抑制转录因子活化蛋白-1和信号分子富半胱氨酸61的mRNA表达，降低单核细胞趋化蛋白-1水平，从而抑制UVB诱导的MMP-1表达增加，发挥其抗衰老的作用。
（六）CGF影响微生物生长的作用：
（1）促进有益菌生长：
1、2001年韩士群等研究了CGF对微生物生长及生理活动的影响，发现CGF具有增加啤酒酵母菌和乳酸菌细胞分裂速度、促进生长的作用 (分别为14.98倍和2.2倍)，还能增加啤酒产气量、调节乳酸杆菌与链球菌比例、延长乳酸制品保质期，改善其品质等。
2、2005年胡开辉等使用不同的破壁方法提取CGF，同样发现CGF具有促进啤酒酵母生长繁殖、加速发酵进程等功能。日本Kanno等从小球藻CK-5藻株中分离得到的642.9 Da的糖蛋白能够促进酵母菌生长。
（2）抑制有害菌
1、陈晓清研究了海水小球藻中粗多糖与粗蛋白的体外抑菌活性，发现多糖提取物抗菌谱比蛋白质提取物抗菌谱广，对中华根霉与稻瘟病菌有极强的抗菌活性；而蛋白质提取物对产黄青霉和中华根霉有较强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌和肠炎病原菌也有抑制作用，但其抗真菌活性比抗细菌活性大。
2、日本Tanaka等发现腹膜、静脉或皮下注射小球藻水溶性高分子量片段 (CE-A)，能够提高小鼠对腹膜接种进入体内的大肠杆菌的抵御能力，CE-A的皮下注射还能预防环磷酰胺导致的小鼠对大肠杆菌抵御能力的减弱。
3、Hasegawa等曾报道口服CGF能够减少大肠杆菌感染小鼠各器官中的细菌数，增加小鼠白细胞数；增强小鼠对单增李斯特菌感染的抵御能力。
（七）CGF的重金属结合作用：
2003年，巴西学者Queiroz等使用Hasegawa提供的CGF进行研究，发现CGF对铅诱导的单增李斯特菌感染小鼠的骨髓抑制具有保护作用。铅诱导同时给予CGF的小鼠，其血铅水平在第10天时能够下降至铅对照组的66.03%，而铅诱导之后给予CGF则效果明显降低，在第3天和第10天分别降低了13.5%和17.5%。
（八）CGF的护肠作用：
1、2001年美国Merchant等在弗吉尼亚联邦大学医学院进行了双盲、安慰剂、随机临床试验。该试验中，患者每日服用10g SUN CHLORELLA公司的纯小球藻片和100 mL含有CGF、苹果酸、果糖、柠檬香精和水的“Wakasa Gold”饮料。在连续服用2个月后，评估了溃疡性肠炎患者的疾病活性指数，发现小球藻日常饮食补充能够加速伤口愈合。
2、韩国Song等研究了CGF对正常大鼠肠内皮细胞增殖和相应信号通路的影响，发现CGF能增加胰岛素样生长因子的表达，促进粘附斑激酶和蛋白激酶的磷酸化，引起丝裂原-活化蛋白激酶通路和磷酸肌醇3-激酶/Akt通路活化。
（九）CGF的保肝作用：
1、2005年中国台湾Wu等研究了CGF对HSC生长的影响，发现CGF能够有效抑制HSC增殖。此外，CGF对四氯化碳 (CCl4) 诱导的急性肝损伤具有保护作用。
2、2009年孟楠等CCl4诱导大鼠急性肝损伤模型，研究CGF对急性肝损伤的防治作用，结果CGF显著降低大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶活性，降低肝组织中丙二醛水平，提高肝组织中谷胱甘肽过氧化酶 (GSH-Px) 活性及GSH含量。
3、2013年韩国Li等也研究了CGF对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的影响及机制，发现CCl4处理显著增加小鼠血清转氨酶水平和脂质过氧化水平，上调细胞色素P450-2E1表达，并降低GSH浓度和一系列细胞氧化防御系统中酶的活性；而以CGF进行预防后上述现象显著扭转。
4、2011年伊朗Sahebkar等通过一项随机临床试验，研究了小球藻膳食补充作为非酒精脂肪肝病人辅助疗法的优点。患者每天联合服用CE (1200 mg)、二甲双胍 (750 mg) 和维生素E (200 mg) 3个月后，其血清转氨酶、甘油三酯和胰岛素敏感指数水平均得到有效改善。
（十）CGF的其他活性：
1、日本Hasegawa等使小鼠目击其同类被足击，从而造成心理紧张状态，而口服CGF能够显著抑制小鼠血清肾上腺酮水平的增加，对小鼠心理紧张所致胸腺细胞凋亡具有预防作用。
2、韩国Kim和An等研究了CGF的抗疲劳和增强体质作用。
3、2010年Kim等发现用小球藻麦芽水解产物处理12d，能显著减少ICR小鼠游泳静止时间，降低血浆中血尿氮水平，而An等也发现，在每天口服CGF (0.05−0.15 g/kg) 7d后，小鼠的游泳静止时间缩短，血尿氮、肌酸激酶和乳酸脱氢酶指标下降。
小球藻生长因子CGF是一种包含了蛋白质、多糖、核酸、多肽、维生素和微量元素等多种物质的混合物，其多样化的物质组成可能是CGF具有多种功效的原因。
研究者们曾经推测核酸是CGF的主要活性成分，但近期诸多关于小球藻水溶性物质生理功能的报道提示，CGF中多肽、多糖和糖肽也各具功效。
（以上研究论文摘要所涉及的参考文献省略）