CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计

大佬说,我只说一次,你自己要记住
以最火热的p53为例

Step 1 先找p53基因序列

1. NCBI--输入p53并选择物种human:tumor protein p53 [Homo sapiens (human)]

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene

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2. Ctrl+F,输入sequence,快速定位(当然其实拉下去就是了),点击Genebank
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3. 下载p53基因序列
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4. 用SnapGene软件打开序列,并简单了解每个元件

最好是可以学一下SnapGene这个软件的使用方法(有视频),个人认为,自行查资料理解每一个元件的含义和作用,可以帮助更快的补充背景知识。通过将散落的知识点集合起来,最后拼凑成自己的知识地图。

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那么,为什么看起来好像这些mRNA都一样,怎么不只放一条完事了?不是滴。。。还有不一样的mRNA。

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在学生信的时候,听到过一个词,“可变剪接”,有了初步印象之后,在这里才算是实实在在看到了,我认真的数了数,mRNA画了15条,TP53蛋白也画了15条。那么我们可以理解为,TP53有15个亚型,当然,每个亚型都有自己的mRNA。

Step 2 分析敲除位点(找到合适的敲除位置)

怎么样才能通过尽量少的sgNRA数量,去敲除尽量多的TP53蛋白。既然是做knockout,那一定是要所有的亚型都不能表达。那么既然如此,就是要敲除掉这些亚型共有的区域,而且越前面越好(如果只敲除尾巴,TP53合成了半个身子,半个身子的TP53说不定也能起作用),另外,也不能敲除掉内含子(说是,如果敲掉了,可能会形成进的剪接,就有新的蛋白出现)----知识点好伐~

1. 发现所有亚型共有区域
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2. 查看详细信息,得知第一个segment(片段)是从12417-12498,一共82 bp
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3. 在Sequence中查看,复制一整个segment的碱基序列如下
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segment碱基序列atggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatg

Step 3 设计sgRNA

首先,先附上鼎鼎大名的张峰实验室提供的网页 https://zlab.bio/guide-design-resources

1. 打开网页,选择网页工具--博德研究所
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2. 粘贴序列,一步到位
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3. 查看结果
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我没有写结果怎么查看,或者分析结果耶,因为。。。因为做到这里,真正想学的人,感兴趣的人早就去看了。

4. 选择目的序列

略略略,哈哈哈哈哈~~

感谢师兄DZ

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