刘小泽写于19.5.6
首先对上次改好名称的fastq数据进行质控
# 以P2586-4为例
mkdir -p $wkd/qc
cd $wkd/qc
find $wkd/raw/P2586-4 -name '*R1*.gz'>P2586-4-id-1.txt
find $wkd/raw/P2586-4 -name '*R2*.gz'>P2586-4-id-2.txt
cat P2586-4-id-1.txt P2586-4-id-2.txt >P2586-4-id-all.txt
cat P2586-4-id-all.txt| xargs fastqc -t 20 -o ./
然后利用Filezilla下载其中SRR7722937的R1、R2的html，打开看下
首先是R1的，这个就是16bp Barcode+10bp UMI，可以看到Phred值是比较稳定的
然后看下真实的测序数据：它的Phred值开始质量较差，中间较好，测序结束位置质量有下降，这是和测序仪的工作原理有关的
测序仪在刚开始进行合成反应的时候也会由于反应还不够稳定，会带来质量值的波动；碱基的合成利用的的是聚合酶化学反应，使得碱基可以从5’端向3’端合成并延伸。但合成的过程中随着链的增长，DNA聚合酶的效率会不断下降，特异性也开始变差，越到后面碱基合成的错误率就会越高）
总体上还是在Q30以上的，数据质量不错，并且没有接头序列
如果要对Fastqc结果进行详细的了解，可以去官网的帮助信息，非常的简明扼要： 官网的说明最原汁原味： 到目前为止，它有1.0，1.1，1.2，1.3，2.0，2.1，2.2，3.0这8个版本，其中1.2版本之后的可以支持Chromium Single Cell 3' v1 and v2 试剂，最新的V3试剂需要用到3.0版本 要分析的文章中使用了两个不同的版本（2.0和2.1）去分析两个患者的数据： 它主要包括四个主要基因表达分析流程： 它的结果主要是包含有细胞信息的 主要根据sample、library、flowcell的数量来定义分析的复杂程度(由浅入深) 一个sample、一个library、一个flowcell 这是最基本的模式：只有一个生物样本，只需要制备一个文库，在一个flowcell上测序就好，通过 一个library，多个flowcell 如果有个文库在多个flowcell上测序，可以利用 Running Multi-Library Samples 将不同测序run的reads混合 一个sample，多个library 如果一个样本有多个文库(比如做了技术重复)，那么每一个文库的数据应该单独跑 多个samples 必须每个样本的每个文库单独跑 大多软件是和Cell Ranger打包在一起的，但是 Cell Ranger默认在本地运行(或者使用 使用 为了复现文章，我们需要用到Cell Ranger 2.0与2.1，其中2.0版本是2017年9月发布的，2.1版本是2018年2月发布的 软件下载完，需要解压缩一段时间，因为它打包了太多的软件和资源 然后添加环境变量(注意：如果之前安装过其他版本，比如我之前装过3.0，但是当前你只想用这个2.0版本，那么就需要在 然后安装好以后，cellranger还提供了一个小工具(我认为是个有意思的地方)，让你全面了解你的linux性能，不用自己找代码。另外这些代码我们也可以借鉴，以后再用 为了确保软件所有的自带流程都成功安装，可以进行一个软件自检 文章比对到了hg38(基于ensembl数据库)，不能直接使用网站下载的基因组与注释文件，需要过滤一下 如果直接下载的话一共11GB，当然这里面包含了基因组、注释源文件，以及cell ranger自己利用 如果要自己尝试构建，可以使用 欢迎关注我们的公众号～_～ Cell Ranger的介绍
什么是Cell Ranger？
Cell Ranger is a set of analysis pipelines that process Chromium single cell 3’ RNA-seq output to align reads, generate gene-cell matrices and perform clustering and gene expression analysis.
那么这个软件能干什么事？
bcl2fastq ，可以将一个或多个lane中的混样测序样本按照index标签生成样本对应的fastq文件mkfastq生成的fq文件，进行比对(基于STAR)、过滤、UMI计数。利用细胞的barcode生成gene-barcode矩阵，然后进行样本分群、基因表达分析cellranger count的输出数据，将同一组的不同测序样本的表达矩阵整合在一起，比如tumor组原来有4个样本，PBMC组有两个样本，现在可以使用aggr生成最后的tumor和PBMC两个矩阵，并且进行标准化去掉测序深度的影响cellranger count或cellranger aggr生成的gene-barcode矩阵，使用不同的参数进行降维、聚类BAM, MEX, CSV, HDF5 and HTML文件相关的术语
大体流程
mkfastq得到fastq文件后直接运行count 就好(具体见： Single-Library Analysis)
cellranger count 流程，然后可以利用aggr整合起来， Multi-Library Aggregation ；
当然先将一个样本的多个文库组合在一起再分析也是可以的，就需要利用到 MRO syntax (这里先做了解)
cellranger count ，比如说：实验中有4个样本，每个样本由两个文库(或者两个技术重复)，那么就需要跑count 流程8次，最后利用aggr汇总在一起Cell Ranger的安装与配置
系统要求
cellranger aggr合并最多250k个细胞软件依赖
cellranger mkfastq 依然需要Illumina bcl2fastq (要求版本2.17以上；如果使用Novaseq，最好用版本2.20或者更高)使用资源限制
--jobmode=local指定)，它会占用90%的空余内存以及所有空余的CPU。如果要进行资源限制，可以使用—localmem或者--localcores
localcores之前，应该先检查ulimit -u，看看服务器最大支持多少用户同时在线，因为cellranger使用一个核就会产生64个用户队列，不能超过这个限定值。例如检查ulimit -u为4096，那么最多设置64个核心，也就是64 * 64 = 4096 ，才不会因为这个报错下载软件
# 2.0版本下载(732M)
curl -o cellranger-2.0.2.tar.gz "http://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-2.0.2.tar.gz?Expires=1557256518&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cDovL2NmLjEweGdlbm9taWNzLmNvbS9yZWxlYXNlcy9jZWxsLWV4cC9jZWxscmFuZ2VyLTIuMC4yLnRhci5neiIsIkNvbmRpdGlvbiI6eyJEYXRlTGVzc1RoYW4iOnsiQVdTOkVwb2NoVGltZSI6MTU1NzI1NjUxOH19fV19&Signature=HoJUuPo4iTFdQgzFU1GH7uKf3uGitQxTjB6WOA9qGPlejf7tNcBPjO65WuSUZ~w8WWdeAvky-oV7XGfheY-bUr2b7QHr7jQEqc84cyU~PLvT~fYjkgC7cG7nlpbJOT~b7U~YH9amvR~SCLlyynp7scPDIA~9~keCYrIPgevTf2QyktybuSyjNTwugefOic~~XFkc9lrS~WQ9MNA1CLl4ExlQKsxWS77PEB6mwrMZXX65obDnZW9fIs3dIny6H5YoadbkgmsT52jmLien6PsG1g2jpAO90pPuHoru8LL64Q9gmB3I0nJAqi3EmrO3GKnUpHUhGb6doKmjSN6XccpmsA__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"
# 2.1版本下载
curl -o cellranger-2.1.1.tar.gz "http://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-2.1.1.tar.gz?Expires=1557260110&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cDovL2NmLjEweGdlbm9taWNzLmNvbS9yZWxlYXNlcy9jZWxsLWV4cC9jZWxscmFuZ2VyLTIuMS4xLnRhci5neiIsIkNvbmRpdGlvbiI6eyJEYXRlTGVzc1RoYW4iOnsiQVdTOkVwb2NoVGltZSI6MTU1NzI2MDExMH19fV19&Signature=RNQd-gTASTQhtnUSBfQWrnqo6Pyy2wDXtV5tlxkG97727GvoRhMqFXbEsz4gJl2BMckdVvW3S1tZRwRo5pmxPzmhq-8RKxf99pGqlzo84HYqhbIRkxXlIbLbj-u3PUJqo8cesWpbSVSKkS2TCNS-9GMFNieQswqMS2-DN4BqoBOJnWr7T4wlOMd9hypXWwOsW2P2fqaM-WP2ooMyo-oIxm3y9gDghXdDEP5lvHU7GCQcFGGexkdIrD6S5p8JPJ1DB5XieGrtEuP1YVp6tLMGXFoRWXS8dQLI1egWDYlOuRaiQgLIb3o5ZxBg5NpzLPP5kDHMAVzJFdBpf~~rkyNYTA__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"
tar zxvf cellranger-2.0.2.tar.gz
~/.bashrc中将新安装的2.0版本路径放在3.0的下方，因为linux是根据$PATH自上而下调用软件的，将新安装的路径放在.bashrc下方，那么在$PATH中显示的就是新路径在上方，它们的顺序是相反的)# 举个例子
# 原来我的~/.bashrc中有个cell ranger 3.0
echo 'export PATH=/home/biosoft/cellranger-2.2.0:$PATH' >> ~/.bashrc
# 现在我想输入cellranger时先调用2.0版本，那就在3.0的下方写上
export PATH=/home/biosoft/cellranger-3.0:$PATH
export PATH=/home/biosoft/cellranger-2.0.2:$PATH
# 然后保存退出，激活环境变量
# 这时查看环境变量
echo $PATH
/home/biosoft/cellranger-2.0.2:/home/biosoft/cellranger-3.0
# 于是输入cellranger，给出的帮助文档就是
cellranger (2.0.2)
Copyright (c) 2017 10x Genomics, Inc. All rights reserved.
-------------------------------------------------------------------------------
Usage:
cellranger mkfastq
cellranger count
cellranger aggr
cellranger reanalyze
cellranger mkloupe
cellranger mat2csv
cellranger mkgtf
cellranger mkref
cellranger vdj
cellranger mkvdjref
cellranger testrun
cellranger upload
cellranger sitecheck
# 成功切换了版本！
$ cellranger sitecheck > sitecheck.txt
cellranger testrun --id=tiny
# 我使用了12个CPU，大约需要20分钟检查完
# 如果成功完整地安装的话，最后会给出这样一个报告：
cellranger testrun (2.0.2)
Copyright (c) 2017 10x Genomics, Inc. All rights reserved.
-------------------------------------------------------------------------------
Running Cell Ranger in test mode...
Martian Runtime - 2.0.2-2.2.2
Running preflight checks (please wait)...
[runtime] (ready) ID.tiny.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.SETUP_CHUNKS
[runtime] (split_complete) ID.tiny.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.SETUP_CHUNKS
...
Pipestance completed successfully!
参考序列下载(1.2.0版本，2016年12月发布)
mkgtf构建的注释和mkref构建的基因组curl -O http://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0.tar.gz
# 然后解压
tar -xzvf refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0.tar.gz
# 下载基因组
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
# 下载注释
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf.gz
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf.gz
# 软件构建注释(可以自选attribute)
# mkgtf
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