8. 三维基因组C系列技术

我们知道三维空间构象对于基因的表达和调控具有重要作用。为了研究基因组的三维结构，人们开发了C系列技术，即染色体构象捕获（3C）技术及其衍生而来的4C、5C、Hi-C、ChIA-PET等技术。这些技术正在以前所未有的分辨率绘制基因组范围内的染色质互作图谱。
Hi-C技术实现了3C到3D的转变，目前科研应用最为广泛，我们明天再把它单独拿出来介绍哦~
接下来我们就来认识一下这些C系列技术吧~
✦3C (Chromatin Conformation Capture)，染色质构象捕获

✦4C (Circularized Chromatin Conformation Capture)， 环状染色质构象捕获

✦ 5C (Chromatin Conformation Capture Carbon Copy)，染色质构象捕获碳拷贝

✦ Hi-C（High-throughput chromosome conformation capture），高通量染色体构象捕获

✦ ChIA-PET: Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing，配对末端标签测序染色质互作分析

相同点：实验的基本原理相同，均会经过甲醛交联DNA与蛋白、限制性内切酶酶切、DNA连接酶连接、解交联纯化DNA等过程。通过PCR或高通量测序对连接产物进行定量，从而获得序列间的空间互作信息。

不同点：具体实验操作流程、分析方法、能解决的问题均不相同。

C系列对比

C系列技术实验流程对比

01. 3C技术

3C：通过交联、酶切、连接、纯化步骤，针对两个目标研究区域设计引物进行PCR，根据PCR产物的量判断目标区域是否存在互作。

优点：准确验证两个目标区域是否存在互作，作用模式one-by-one；

缺点：通量低、需设置BAC质粒作为对照。

3C结果展示

02. 4C技术

4C：通过交联、酶切、连接、纯化、二次酶切、连接环化步骤，针对目标研究区域（bait或viewpoint）设计引物进行反向PCR，对PCR产物进行二代高通量测序，根据测得的配对reads数目对互作信号的强度进行定量。

优点：验证一个目标区域与基因组其它区域的互作，作用模式one-by-all；

缺点：反向PCR过程受GC含量异常区的影响较大，导致互作结果的偏好性。

4C结果展示

03. 5C技术

5C：通过交联、酶切、连接、纯化步骤，设计多对引物进行PCR，对PCR产物进行二代高通量测序。实验过程与3C相同，区别在于5C需设计成百上千对引物（含通用引物接头序列），在一次PCR过程中扩增出多样性的不同产物。

优点：检测多个区域互相之间的作用，作用模式many-by-many；

缺点：引物设计复杂、PCR冗余度难以评估、覆盖度有限。

5C结果展示

04. Hi-C技术

Hi-C：通过交联、酶切、生物素标记、连接、解交联、超声波打断、链亲和素磁珠捕获、纯化步骤，对捕获片段进行二代高通量测序。根据测得的配对reads数目对互作信号的强度进行定量。

优点：高通量检测全基因组区域的互作网络，作用模式all-by-all；

缺点：数据量大、分析难度高

Hi-C结果展示

05. ChIA-PET技术

ChIA-PET：通过交联、超声波打断、免疫共沉淀、添加linker序列连接、酶切、解交联、纯化步骤，对获得片段进行二代高通量测序。根据测得的配对reads数目对互作信号的强度进行定量。

优点：高通量检测特定蛋白介导的全基因组区域互作网络，作用模式all-by-all (protein)；

缺点：需获得检测蛋白的特异性抗体、实验难度高

ChIA-PET结果展示

以上就是C系列技术的简要介绍，当前应用 最为广泛的则是Hi-C技术，可用于染色体水平参考基因组构建、全基因组互作网络及空间结构分析、基因组单体型构建等。

以下是详(luo)细(suo)的介绍

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3C技术主要包括六步。第一步，固定。使用固定剂（常为甲醛）将靠近染色体的2个区域相连，固定剂在这里发挥了“双面胶”的双向抓牢作用，使原本结构可变的染色体“静止”，以利于后续操作。如果一条染色体内部被固定，常形成环状结构。第二步，酶切。对固定后的染色体使用限制性内切酶处理。一般使用识别6碱基的限制性内切酶进行操作，理论上每4096（46）个碱基就存在一个酶切位点.通过酶切，可将环内部剪切为多个片段。第三步，连接。使用DNA连接酶使切断的DNA片段重新连接，形成一个DNA环。第四步，解环。被固定的DNA解除交联，使环状DNA线性化。第五步，扩增。例如，原来线性DNA存在A—E共5个片段，推测形成空间结构后，A和E可能靠近，因此在A片段和E片段靠近限制性内切酶识别位点之处，设计引物，并以线性DNA为模板，进行半定量或定量的聚合酶链反应（PCR）扩增。第六步，判定。根据不同引物组合的扩增效率，确定2个片段空间靠近的概率。3C技术主要确定“一对一”关系，就是线性距离较远的2个DNA片段之空间关系。例如借助3C技术阐明了，在红细胞内β-珠蛋白基因表达过程中，存在远距离调控的现象。

3C技术的发明在染色体DNA空间结构研究领域具有里程碑的意义，该技术随后得到进一步的完善与发展，并导致一系列衍生技术的问世。

4C（3C-on-chip或circular 3C）是2006年在3C基础上的一种改进技术。接着3C技术的第四步，对解环后的DNA再进行限制性内切酶处理（此步骤一般用4碱基识别酶），然后连接环化产生一个新的DNA环，以此DNA为模板进行扩增。在引物设计方面，都在A片段靠近酶切位点之处，从而扩增到与A可能存在空间关系的片段，再借助基因芯片或者测序方法确定这些片段的位置。从原理上可以看出，4C解决的是DNA片段“一对多”的关系。

5C（3C carbon copy）技术是在2006年出现的另一版本的3C衍生技术。其原理在于，对3C第四步解环DNA两端加上接头（携带有通用性引物），然后在中间酶切位点处设计左向和右向引物，这些引物除与靶点配对外，还外加一段兼并序列，随后进行扩增，用扩增产物通过基因芯片或测序来确定具体位置。从实验过程可以得出，5C解决的是DNA片段“多对多”的关系。此外，3C还演变出ChIP-loop [chromatin immunoprecipitation（染色质免疫共沉淀）-loop] 技术，它是在3C技术酶解和连接两步之间补充一个染色质免疫共沉淀过程，目的在于研究DNA成环过程中相关蛋白质的作用。

尽管从3C演变到5C，极大地深化了对染色体片段间相互关系的理解，但仍无法从整体上认识染色体的3D结构。Hi-C技术实现了3C到3D的转变

通过Hi-C技术所做出的一个重大发现是，从染色体中鉴定出大量的拓扑相关结构域（topologically associated domain, TAD）。TAD是指一个DNA区域，区域内DNA片段更倾向于自我相互作用，而不与其他DNA片段接触。TAD结构在果蝇和哺乳动物中普遍存在，既被认为是一种染色体亚结构，又被看作一种功能单元。TAD通常由多个染色体环组成，而且其结构的形成和维持还要CTCF和黏连蛋白（cohesin）复合物等参与。

借助Hi-C技术还发现，整个染色体可分为2类明显的区室（compartment）结构，分别称为区室A和区室B。与TAD的性质类似，区室结构也具有空间自我相互作用（A更倾向于A，B更倾向于B）。区室A聚集了活性表达基因，结构较为疏松，一般位于细胞核的中心区；区室B则极少含有编码基因，转录不活跃，结构紧凑，主要占据细胞核的外周区。区室结构的存在说明，染色体基因在空间上具有成簇性，从而有利于细胞核中心区的转录复合物在发挥活性的时候效率提高。

染色体域(chromosome territory)是指某条染色体倾向于占据细胞核内特定的位置，如人19号染色体富含基因，它通常占据活跃转录的中心区；而含基因较少的18号染色体，则更多地被排斥于外周区。染色体域的存在，说明单条染色体并非随机排布，而是根据需要有序地排列。不同染色体的占位以及它们之间的相互作用，对于它们功能的发挥有重要影响。

染色体3D结构 A.局部结构 B.整体结构 C.结构层次

借助Hi-C等技术，已经揭示了真核生物染色体在细胞核内可形成层次分明的各级结构，从线性一级结构、双螺旋（超螺旋）、染色质环、TAD、区室、染色体域，一直到完整的多染色体3D结构。不同层次结构的有序性，是细胞正常功能的基础，而这些结构的紊乱，是多种疾病发生的重要原因。