医学生物信息学文献第6期：CXCR3趋化因子系统在肿瘤内的活性是抗PD-1治 疗有效性的必要条件

​这一期给大家带来一篇今年刚刚发immunity上的文章。CXCR3趋化因子系统在肿瘤内的活性是抗PD-1治疗有效性的必要条件。

文章整体内容

PD-1-PD-L1通路抑制是肿瘤免疫治疗的重要手段，然而，目前仅有部分人群能从抗PD-1治疗中获益。因此，我们需要进一步明确PD-1抑制剂介导CD8+T细胞 抗肿瘤应荅增强的机制，以扩大PD-1抑制剂的有效人 群。有研究表明，在抗PD-1中，细胞因子与肿瘤微环 境中的T细胞浸润和患者生存率相关。CXCR3是高表达于活化T细胞表面的一类趋化因子受体，与T细胞的分布、迁移和功能密切相关。因此，本研究拟探究CXCR3趋化因子系统在PD-1阻滞引起的抗肿瘤免疫中的作用。

作者将抗PD-1治疗敏感性作为切入点，探究CXCR3趋化因子系统在抗PD-1治疗介导的抗肿瘤免疫应答中的作用。首先，作者先利用CXCR3基因敲除小鼠来判断CXCR3在抗PD-1治疗中的作用。在确定CXCR3可介导抗PD-1治疗的抗肿瘤作用后，作者进 一步探究其作用机制。基于前期研究的基础，作者先是假设CXCR3可影响CD8+T细胞向肿瘤中的浸润。通过检测野生型和CXCR3基因敲除小鼠抗PD-1治疗前CD8+ T细胞的数量，作者否定了这一假设。随后，作者又比较了治疗后两组小鼠CD8+ T细胞的差异，并发现CXCR3的作用主要是使肿瘤内的浸润性CD8+ T 细胞活化和增殖。随后，作者进一步探究CXCR3是否参与抗PD-1治疗过程中CD8+ T细胞向肿瘤中的募集。作者利用FTY720处理证实了抗PD-1治疗引起的抗肿瘤作用是由治疗前已经存在于肿瘤微环境中的CD8+ T 细胞介导的，而CXCR3的作用是在PD-1阻断后促使这些CD8+T细胞活化和增殖。由于表达CXCR3的细胞很多，作者又探究了是否只有表达于CD8+T细胞表面的CXCR3才能发挥上述功能。通过构建骨髓移植小鼠模型，作者证实了上述结论，并发现CD8+T细胞表面 的CXCR3的比例与肿瘤生长呈负相关。明确了 CXCR3 的具体作用后，作者又开始探究CXCR3趋化因子系统中其他成分的作用。作者先对CXCR3的配体，CXCL9 和CXCL10的表达进行了检测，并发现抗PD-1治疗后两种配体的表达量升高。随后，作者探究了两种配体各自的作用，并发现主要由CD103+DC产生的CXCL9介导抗PD-1治疗应达。在明确了CXCR3趋化因子系统在抗PD-1治疗中的作用后，作者开始探究其临床意义。由于表观遗传调节剂可以增加CXCR3的配体的表达水平，作者先是验证了表观遗传调节剂对抗PD-1治疗敏感性的影响。结果表明，表观遗传调节剂可提高肿瘤对抗PD-1治疗的敏感性，甚至将无应达者转为应答者。此外，无论是在肿瘤组织中还是患者的血浆中，CXCL9和CXCL10的表达情况均与免疫治疗应达相关，提示CXCL9和CXCL10可作为免疫治疗应达的早期生物标志物。

(1) CXCR3是抗PD-1治疗出现有效应达的必要条件， PD-1阻滞引起的功能性CD8 + T细胞应达依赖于CXCR3

这项研究拟探究CXCR3趋化因子系统在PD-1阻滞引起的抗肿瘤免疫中的作用。因此，作者首先初步探究 了CXCR3的存在与否对抗PD-1治疗效果的影响。作者构建了野生型和CXCR3基因敲除小鼠模型，并利用两种已知对抗PD-1治疗敏感的细胞系(MC38 和D4 M.3A.3 UV3 ) 进行皮下成瘤，并予以抗PD-1 治 疗。结果表明，相比于野生型小鼠，CXCR3基因敲除小鼠抗PD-1治疗效果较差。研究表明，CXCR3参与T细胞向肿瘤微环境中的募集。而抗PD-1治疗前肿瘤微环境中预先存在的CD8+T 细胞对有效的抗PD-1治疗至关重要。因此，作者拟探究CXCR3在抗PD-1治疗应答调控中的具体作用环节。根椐上述理论，作者假设CXCR3敲除影响了肿瘤微环境中CD8+T细胞的早期浸润。然而，通过流式细胞学分析，作者发现抗PD-1治疗早期野生型和CXCR3基因敲除小鼠肿瘤内CO8+T细胞和抗原特异性CD8+T细胞的数量、比例和功能没有明显差异。因此否定了这一 假设。随后，作者又对开始接受抗PD-1治疗的小鼠进行了上述检测。并发现抗PD-1治疗可使野生型小鼠肿瘤内CO8+T细胞数量明显增加。IFN-γ和TNF-α的表达也增多，而CXCR3基因敲除小鼠肿瘤内却没有类似的现象。通过检测能反映抗PD-1治疗后抗肿瘤CD8+丁细 胞应达的标志物Ki-67和颗粒酶B。作者发现，抗PD-1 治疗可使野生型小鼠肿瘤内表迖Ki-67和颗粒酶B 的CD8+TCO8+T细胞比例增加 .CXCR3基因敲除小鼠肿瘤内则不然。因此，作者推断CXCR3参与抗PD-1治疗介导的肿瘤内部CD8+T细胞的增殖和细胞毒性作用。

图1 : CXCR3是抗PD-1治疗应荅的必要条件。图1A是构建小鼠模型及给药的流程示意图。图1B-C分別是两种荷瘤小鼠接受抗PD-1治疗后的肿瘤生长曲线和生存曲钱。如图所示，相比于野生型小鼠，CXCR3基因敲除小鼠抗PD-1治疗效果较差，生存时间更短。图1D-E分別为抗PD-1治疗早期野生型和CXCR3基因敲除小鼠肿瘤內CD8+T细胞的数量和细胞因子产生情况。如图所示，抗PD-1治疗早期野生型和CXCR3基因敲除小鼠肿瘤内CD8+T细胞的数量和细胞因子的产生情况没有明显差异。图1F-H分別为抗PD-1治疗开始后两种小鼠肿瘤中CD8+T细胞的数量，细胞因子产生和抗肿瘤应答的检测结果。如图所示，抗PD-1治疗可使野生型小鼠肿瘤内CD8 + T细胞数量和比例明显上升，并使IFN - γ和TNF-α的表达增力。且这些CD8+T细胞具有抗肿瘤应达功能。而CXCR3基因敲除小鼠中，抗PD-1治疗却没有得到类似的效果。

(2)抗PD-1治疗促进肿瘤内免疫应答

为进一步明确CXCR3是否参与抗PD-1治疗过程中的CD8+T细胞募集，作者利用FTY720 (—种S1P1受体的功能性拮抗剂)来阻断外周淋巴器官释放T细胞。 作者发现，在抗PD-1治疗前—天用FTY720处理可使外周血T细胞数目明显滅少。但抗PD-1治疗仍可引起肿瘤內的CD8+T细胞数量增加。且在野生型荷瘤小鼠模型中，在抗PD-1治疗过程中给予FTY720处理并不影响抗PD-1治疗引起的肿瘤生长抑制。而在种瘤前给予FTY720处理则可显著抑制抗PD-1治疗的效果。上述结果表明，抗PD-1治疗引起的抗肿瘤作用主要由治疗开始前就已经存在于肿瘤微环境中的T细胞来介导。为了进一步验证肿瘤內T细胞的增殖是引起抗PD-1治疗介导的T细胞数目增加的原因，作者通过MTT实验检测抗PD-1治疗前后肿瘤及引流淋巴结中T细胞的增殖情况。结果表明，抗PD-1治疗可使野生型小鼠肿瘤中的CD8+T细胞出现明显增殖，而CXCR3基因敲除小鼠体内则没有类似的效应。由此可以推断CXCR3趋化因子系统对PD-1阻滞后肿瘤微环境中的T细胞增殖至关重要。  

图2 :预先存在于肿瘤内的CD8+ T细肥群足以发挥抗PD-1治疗介导的胂瘤抑制作用。图2A为抗PD-1治疗和FTY720处理的给药时间示意图。图2B为外周血T细胞的流式细胞学检测结果，提示抗PD-1治疗前FTY720处理可减少外周血中T细胞数目。图2C-D分 別为治疗第15天小鼠肿瘤內CD8+ T细胞数目及肿瘤大 小和小鼠的生存情况。由此可见，抗PD-1治疗过程中同时给予FTY720处理对小鼠肿瘤微环境中的CD8+T 细胞数目和抗PD-1治疗的疗效均无明显影响。图2E为种瘤前给予FTY720处理的给药时间示意图及相应的抗PD-1治疗应答情况。结果表明，种瘤前给予FTY720处理则可显著抑制抗PD-1治疗的效果；图2F为两组小鼠模型抗PD-1治疗前后的T细胞增殖情况。如图所示，抗PD-1治疗可使野生型小鼠肿瘤中的CD8+T细胞出现明显增殖。而CXCR3基因敲除小鼠体內则没有类似的效应。  

(3) CD8+ T细胞表面的CXCR3对抗PD-1治疗介导的CD8+ T细胞激活至关重要

随后，作者进一步探究是否只有表达于CD8+ T表面的CXCR3才能介导抗PD-1治疗引起的CD8+ T细胞激活。为此，作者构建了骨髓移植小鼠模型，即将野生型和CXCR3基因敲除小鼠的骨髓1 : 1混合移植入辐射后的C57BL/6小鼠体内，并依次进行皮下成瘤和FTY720处理及抗PD-1治疗。理论上讲，成瘤后药物处理前，小鼠肿瘤内野生型和CXCR3基因敲除型CD8+ T细肥的比例应接近1 : 1。因此，作者利用流 式细胞学技术检测了抗PD-1治疗后两种CD8+ T细胞的 比例变化情况。结果表明，抗PD-1治疗后，相对于野 生型CD8+T细胞，肿瘤内部CXCR3基因敲除型CD8+ T细胞、抗原特异性CXCR3基因敲除型CD8+ T细胞均有所减少。此外，在同一肿瘤中，抗PD-1治疗可促进野生型CD8+ T细胞产生IFN-γ和TNF-α，而对CXCR3基因敲除型CD8+ T细胞的细胞因子表达没有明显影响。上述结果表明CD8+ T细胞依赖于肿瘤微环境中內源性 的CXCR3信号通路来介导抗PD-1治疗引起的抗肿瘤作用。