CRISPR/Cas9技术的原理与运用

CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫系统，其以消灭外来的质体或者噬菌体并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”。CRISPR/Cas系统全名为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(clustered regularly

interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。目前已发现三种不同类型的CRISPR/Cas系统，存在于大约40%和90%已测序的细菌和古菌中。其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心的组成。由于其对DNA干扰(DNAi)的特性，目前被积极地应用于遗传工程中，作为基因体剪辑工具，与锌指核酸酶(ZFN)及类转录活化因子核酸酶(TALEN)同样利用非同源性末端接合(NHEJ)的机制，于基因体中产生去氧核糖核酸的双股断裂以利剪辑。二型CRISPR/Cas并经由遗传工程的改造应用于哺乳类细胞及斑马鱼的基因体剪辑。其设计简单以及操作容易的特性为最大的优点，未来将可应用在各种不同的模式生物当中。    由于CRISPR/Cas技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑，为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台，受到众多科学家的追捧。CRISPR-Cas技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。但是其也有脱靶和剪切不准确的机率，张锋和同事们利用Cas9蛋白的结构知识：负电荷的DNA结合到了Cas9蛋白一个正电荷的凹槽中，来减少了脱靶切割。知道了这一结构，科学家们可预测出用一些中性氨基酸来替代正电荷的氨基酸，相比于“靶向”序列，可以大大减少Cas9与“脱靶”序列的结合

1. CRISPR/Cas9技术原理与基因修饰

1.1 CRISPR/Cas9技术原理

CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。如图所示，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列，病

毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序）。当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR

RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。

1.2  CRISPR/Cas9与基因修饰

    正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。在CRISPR/Cas9技术中，我们把即将被编辑的细胞基因组DNA看作病毒或外源DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白。

     其中，向导RNA的设计并不是随机的，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（即三碱基序列NGG，其中N可以是任意碱基而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。），而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。

     对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。

2.CRISPR/Cas9技术的运用

2.1 CRISPR/Cas技术与基因敲出动物模型

基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。

    而CRISPR/Cas技术运用于DNA片断的插入或定点突变的实现，只需在此基础上为细胞提供一个修复的模板质粒，这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变，对受精卵细胞进行基因编辑，并将其导入代孕母体中，可以实现基因编辑动物模型的构建。Rudolf Jaenisch教授采用CRISPR/Cas技术成功构建了同时携带多个基因突变的小鼠。CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，且可绕开胚胎干细胞操作过程。该技术将重新定义模式动物。

     猪成为基因组编辑的一线对象狗、羊和猴子都已经成为基因组编辑的对象。但是猪最近成为基因组编辑的核心目标，中国学者最近宣布将编辑体重只有普通猪1/6的微型宠物猪，中国和韩国学者联合编辑健美肌肉猪，美国学者对62个基因同时进行编辑制造能给人类移植器官的猪。

2.2 CRISPR/Cas9与生物医学

医疗健康领域，用iPS细胞（诱导多能干细胞）治疗人类的镰刀形贫血症，可以将病人的皮肤细胞诱导成iPS细胞，利用CRISPR/Cas9技术介导同源重组来修复发生突变的血红蛋白基因，再将修复的iPS细胞定向诱导分化为造血干细胞移植到病人体内。此外，像使用CRISPR技术根除HIV病毒、诱导宫颈癌细胞自我毁灭、构建癌症模型等最新成果先后被Nature等著名杂志所报道。在奶制品的发酵中，利用CRISPR/Cas9增强发酵菌株对噬菌体的防御能力；在家畜育种方面，也正在利用基因编辑工具通过对显着影响家畜生产性能的基因位点进行改良，以实现猪、牛、羊等大型家畜生产性能的提高等

2.3 CRISPR/Cas9的其它运用

近日，来自美国的科学家在国际期刊Nature发表了他们的最新研究成果，他们利用结构导向的方法改造了CRISPR-CAS9复合物来系统性研究基因功能，并通过构建sgRNA文库大规模筛选抵抗BRAF抑制剂的激活基因。该文章利用CRISPR-CAS9技术研究基因功能，对后基因组时代的基因功能研究具有推动作用。

最近MIT研究团队建立了70，290个引导RNA的文库，来靶标人类基因组超过两万个基因。他们由此鉴定了让黑色素瘤抵抗药物PLX-4720的基因。PLX-4720对于携带BRAF突变的患者疗效比较好，残存下来的癌细胞会长成新的肿瘤，导致癌症复发。然后，研究人员将CRISPR元件引入大量体外培养的黑色素瘤细胞，不同细胞对应靶标不同基因的引导RNA。然后他们用PLX-4720处理这些细胞，由此鉴定帮助癌细胞生存的基因

展望

虽然CRISPR/Cas9技术面临脱靶的的缺点，但近来在发表于《科学》(science)杂志上的一篇新研究论文中，张锋（Feng Zhang）和同事们报告称，在构成化脓性链球菌Cas9酶的约1400个氨基酸中，他们通过改变3个氨基酸将“脱靶编辑”显着减少至无法检测到的水平。众所周知，癌症日益成为威胁人类健康最大的敌人之一，未来，利用CRISPR/Cas9编辑技术也许我可以任意剪切掉突变的癌基因来治疗癌症，或者用来编辑人的免疫细胞，来增强其对癌细胞的杀伤力，研究者目前正在开发修饰化的Cas9来在造血干细胞中直接修复引发疾病的突变，用来治疗慢性肉芽肿病患者，他们的最终目的就是将正确的细胞再次插入到患者机体中帮助患者恢复机体免疫功能，从而达到疾病治愈的目的。我们知道Cas9不是唯一的酶，还包括Cpf1、C2C1和C2C3剪切酶，另外，基因编辑不需要专业人员，这样就大大增加其简单实用性，相信，随着CRISPR/Cas技术不断运用，在农业，医学，健康，研究领域大有作为。不久的将来，我们也许就会食用CRISPR/Cas技术生产的产品。