生信-使用NCBI进行目的基因的引物设计

使用NCBI进行目的基因的引物设计

全文概述

利用生信工具进行目的基因的引物设计，使用了NCBI进行筛选与设计引物，使用 idtdna对筛选出的DNA进行检查。本文分享了如何筛选出高质量的基因引物，帮助想通过生信进行引物设计的学生、从业者找出合适的基因，毕竟购买引物也比较烧钱，避免设计出的基因质量偏低。

NCBI查找基因

1.查询目的基因：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=zbed3

备注：这里需要注意的是，要找到合适的目的基因！如果找智人，一般会是NM开头

2.选择其中一个数据连接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001329564.2，选择Pick Primers

3.进入：

设计-筛选设置

4.根据一些实验经验调节一些关键参数：

1）Primer Parameters-PCR product size：设置为75-300

2）Exon/intron selection- Exon junction span：设置必须跨越外显子（Primer must span an exon-exon junction），避免污染

3） Advanced parameters - Primer Parameters：GC建议在40%-60%之间

5.点击Get Primers

6.跳转页面

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1561727583&job_key=v7VgKRZ5G9E86w3uAI4p3HqVOO5XhiPzVg

7.挑选合适的primer pair，其中product length最好是在150附近（不是绝对）

设计-DNA检查

8.注册idtdna进行dna分析，https://sg.idtdna.com/calc/analyzer

9.抽取其中一个primer pair

Primer pair 6

Sequence (5’->3’)	Template strand	Length	Start	Stop	Tm	GC%	Self complementarity	Self 3’ complementarity
Forward primer	ACAGCAACACAGAAGACCGT	Plus	20	604	623	59.82	50.00	3.00	3.00
Reverse primer	CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC	Minus	21	749	729	59.87	52.38	6.00	3.00
Product length	146
Exon junction	737/738 (reverse primer) on template NM_001115114.1

Products on intended target

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NM_001115114.1 Danio rerio glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapdh), mRNA

product length = 146

Forward primer 1 ACAGCAACACAGAAGACCGT 20

Template 604 … 623

Reverse primer 1 CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC 21

Template 749 … 729

10.使用idtdna进行筛选

举例：正旋：ACAGCAACACAGAAGACCGT，反旋：CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC

以此使用正旋与反旋填写入sequence，如图使用正旋，点击self-dimer，如果序列结果中，basePairs都小于10，那么这个引物就算比较好的了，不是自旋产生的。

11.接着正反计算，输入正反旋，年级HETERO-DIMER,最后点击CALCULATE，如果序列结果中，basePairs都小于10，那么这个引物就算比较好的了，不是自旋产生的。