【干货盘点】ChIP-seq实验篇,你需要了解这几点

目前,研究组蛋白修饰和转录因子结合位点较为成熟的技术是染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP),它是研究生理状态下目的蛋白和DNA相互作用较早的一种方法。ChIP结合高通量测序手段,可以在全基因组范围内高分辨率的检测特定修饰组蛋白位点、转录因子互作DNA片段等。

【干货盘点】ChIP-seq实验篇,你需要了解这几点_第1张图片

基于我们之前项目遇到的咨询问题,给大家总结分享ChIP-seq过程中几个关键问题点。

实验篇:抗体-ChIP成功的关键、IP前超声破碎检测的重要性,为什么需要设置对照;

测序分析篇:合格的ChIP-seq文库、链互相关性分析、经典案例回顾。

欢迎各位专家、同学共同参与讨论,我们会第一时间回复答疑。

首先我们简单梳理下ChIP-seq基本流程:

【干货盘点】ChIP-seq实验篇,你需要了解这几点_第2张图片

图1 ChIP实验流程

图片来源:https://www.creativebiomart.net/blog/principle-and-protocol-of-chromatin-immunoprecipitation-chip/

1. ChIP样本预处理:细胞通透性增强,甲醛溶剂使目的蛋白与DNA交联。细胞裂解提取核DNA;

2. DNA片段化处理:使用超声破碎或者微球菌核酸酶进行消化;

3. 超声破碎结果检测:取部分破碎产物解交联,凝胶电泳检测总DNA完整性和片段化情况;

4. 分组:超声破碎产物,取三分之一加抗体-磁珠为实验组,孵育形成磁珠-抗体-靶蛋白-DNA复合物;另三分之一直接解交联,DNA纯化为对照组(Input);

5. 免疫沉淀:Protein A/G beads和抗体反应,然后加染色质,孵育后上磁力架,洗脱得到抗体-目的蛋白-DNA复合物。洗涤纯化去除非特异性结合的DNA片段;

6. 解交联:蛋白酶K/NaCl处理,解除交联,DNA纯化回收;

7. 高通量测序:建库、文库质检,上机测序,信息分析。

【干货盘点】ChIP-seq实验篇,你需要了解这几点_第3张图片

01.ChIP实验成功的基础—抗体的选择

◆ 一定要选择ChIP级别抗体

一定要选择ChIP级别抗体!一定要选择ChIP级别抗体!一定要选择ChIP级别抗体!抗体研发成功后会进行WB、IP、IHC、ChIP-qPCR等实验,并且标注在产品上。例如在abcam的官网上搜索抗Dnmt1的抗体得到下图,其中明确描述是ChIP级别,可应用于ChIP、FC、IHC和WB等实验。

【干货盘点】ChIP-seq实验篇,你需要了解这几点_第4张图片

◆ 没有ChIP级别的抗体,可以用WB级别的么?

不建议使用WB级别抗体做ChIP实验,一个是WB抗体浓度低会破坏ChIP的体系;一个是WB的蛋白是加热变性后的结构,ChIP实验中最好用天然蛋白做的抗体去结合生理状体下的蛋白质。

◆ 实在没有合适抗体的情况下怎么办?

可以考虑构建标签蛋白(His、Flag、HA)融合蛋白表达质粒,目的蛋白和标签蛋白在受体材料中融合表达后,利用标签特异性抗体捕获标签蛋白-目的蛋白—DNA复合物。

但是标签系统有一定的风险性:1)可能存在标签蛋白分子量太大空间阻位影响目的蛋白和DNA的结合;2)可能存在标签蛋白和DNA结合的风险;3)内源性目的蛋白和标签目的融合蛋白竞争性结合DNA,导致富集位点减少。

【干货盘点】ChIP-seq实验篇,你需要了解这几点_第5张图片

02.IP前超声破碎检测的重要性

先上一张较为理想的超声破碎结果图:

【干货盘点】ChIP-seq实验篇,你需要了解这几点_第6张图片

泳道从左到右依次是Marker,提取的总DNA,片段化后的DNA样本

从以上电泳图可以看到两个主要的质检指标:1.提取DNA的完整性;2.超声破碎的片段范围和均一性。ChIP-seq检测的是机体生理状态下目的蛋白和DNA的结合状态,如果提取的DNA完整性较差,可能导致目的蛋白脱离DNA,影响后续富集分析。

片段化结果较差的三种情况:过度片段化小于100bp、片段化过长大于1000bp、片段化不全。以组蛋白修饰为例说明下这三种结果较差的影响,每个核小体上的DNA长度在154-260bp范围内变动,片段太小蛋白DNA位点有可能被打断;片段太大可能很长一段DNA区域为非结合片段同时不利于抗体结合目的蛋白。

IP下的DNA后续用于高通量测序建议片段长度在200-500bp。以上示意图中, 片段从Lane1泳道可以看出DNA的完整性较好,从Lane2可以看出DNA片段化较为均一,主要集中在100-500bp,这样结果可用于后续富集测序分析。

03.设置对照组

ENCODE和modENCODE计划发表的ChIP-seq实验指南一文中指出为了数据分析的准确性一定要设置对照组[2]。这里介绍下指南中两组对照:

input对照:前面ChIP-seq实验流程中介绍了input对照样本的产生过程:没有经过免疫沉淀的超声破碎后的总DNA样本。为什么一定要设置input组,这是因为超声破碎过程中DNA的断裂不是随机的,尤其是一些开放染色质区域在超声样本中优先累积[1],已发表文章结果表明未经过IP的样本超声破碎后会产生数量不小的peaks[2]。同时,IP过程中会有非特异性结合的情况,Input对照可以协助排除IP结果中的假阳性peaks。

阴性对照:前面提到目的蛋白的抗体可能非特异性结合,而IgG不能结合染色质上任何蛋白质[2],此时IgG对照组带下来的蛋白质-DNA复合物即为背景噪音。目前,做ChIP-seq的公司,其阴性对照组不会做后续高通量测序,一般Qbit检测不到DNA浓度即判断为阴性对照结果良好。

另外,使用标签抗体的实验建议增加标签空载阴性对照:标签抗体使用中提到,标签蛋白有可能结合DNA,建议将标签空载作为标签目的融合蛋白的阴性对照,做后续比对分析。

文章转自金唯智生物科技公众号  原创: 徐琳

你可能感兴趣的:(【干货盘点】ChIP-seq实验篇,你需要了解这几点)