第二十章：高效液相色谱法

第二十章：高效液相色谱法

与经典色谱比较优点：

• 柱效高
• 流速快、分析速度快
• 灵敏度高

与气相色谱比较：

• 不受挥发性和热稳定性影响
• 可选用不同溶剂作为流动相，分离选择性高
• 不需要高柱温

第一节：高效液相色谱法主要类型

高效液相色谱法分类

按固定相聚集状态：液液色谱法、液固色谱法

按分离机制：分配、吸附、离子交换、分子排阻四类基本机制

其他分离机制：亲和色谱法、手性色谱法、胶束色谱法、电色谱法、生物色谱法

目前最常用固定相是化学键和相，称为化学键和色谱法

化学键和相色谱法

键合相：通过化学反应将有机基团键合在载体表面构成的固定相

正相NP、反相RP

正相键合色谱法

采用氰基、氨基等作为固定相，非极性或弱极性溶剂为流动相。

分离极性至中等极性分子行化合物

分离机制一般认为是分配，也有认为是吸附如形成氢键的

一般规律：剂型强的组分容量因子k大，后出。流动相极性增强洗脱能力增强

反相键合相色谱法

十八烷基硅烷、辛烷基硅烷等，有时也用弱极性或中等极性

流动相以水作为基础溶剂再加一定量极性调整剂

分离机制有争论，多种理论模型

影响组分保留行为的主要因素：

1. 组分分子结构：极性强弱

2. 流动相：k的对数值与流动相中有机溶剂的含量通常是线性关系，有机溶剂含量增加，k减小。

   流动相pH通过改变组分理解程度改变t_R，因此常加入少量弱酸、弱碱、缓冲液从而抑制组分离解，增加与固定相作用，这种色谱法称为离子抑制色谱法（ISC），适用于pK_a3~7，pK_a7~8的组分。组分离子态与分子态共存会使峰变宽拖尾。还要注意流动相pH不能超过允许范围

3. 固定相：键合烷基的长度，浓度越大，k越大

分离非极性至中等极性组分

反相离子对色谱

离子对色谱法（IPC）分正相和反相，正相已经少用。

反相离子对色谱法（RP-IPC）是把离子对试剂加入到含水流动相中，使被分析组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不带电荷的中性离子，使组分k增加，用于分离可离子化或离子型化合物

1. 离子对模型（保留机制）：试样离子在流动相中与离子对试剂离解出的反离子生成不带电荷的中性离子，然后在非极性固定相上产生保留。

2. 影响容量因子的因素：

   1. 离子对试剂的种类和浓度：酸类一般用季铵盐（TBA，CTAB），碱类一般用烷基磺酸盐或硫酸盐（PICB）。

      组分分配系数随离子对试剂浓度升高而增大，然后趋于稳定。对于长链离子对试剂，当离子对试剂浓度超过一定值时，k反而减小，是因为形成了胶束。

   2. 流动相pH：调节pH使离子对试剂完全离子化时最有利于离子对形成

   3. 有机溶剂及其浓度：流动相中所含有机溶剂比例越高组分k越小

用于生物碱类、儿茶酚胺类、有机酸类、维生素类、抗生素类药物分析

其他高效液相色谱法

离子色谱法

离子色谱法：将离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法

可以分析无机和有机阴阳离子，氨基酸、糖类、DNA和RNA的降解产物

分为抑制型（双柱型）、非抑制型（单柱型）

对于X^-离子：

双柱型使用两根离子交换柱，一根为分离柱，填有低交换容量的阴离子交换剂，另一根为抑制住，填有高交换容量的阳离子交换剂，两者串联。进入分离柱的组分X^-按正常离子交换色谱分离，在进入抑制柱，除去组分中的OH^-从而使本底电导率降低，利于较大电导率HX的检测。

非抑制型可使用更低交换容量的固定相，浓度很低、电导率很低的流动相，这样本底电导率低，试样离子被洗脱后可直接被电导检测器检测

手性色谱法

利用手性固定相（CSP）、手性流动相添加剂（CMPA）分离分析手性化合物的对映异构体的色谱方法。还有间接法（加入手性试剂使一对对映体转变为非对映体用常规方法分离）。

环糊精（CD）也是一种手性选择剂，分离机制主要是由于分子内熟睡空腔的动销和多手性中心的作用，如果对映体能被空腔紧密包络，而且与CD分子外沿的仲醇基作用，则被固定相保留，两对映体与CD作用程度不同从而分离。

亲和色谱法

亲和色谱法（AC）利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂试样中分离和分析能产生转移性亲和作用的物质的一种色谱方法。选择性最高。

第二节：高效液相色谱法的固定相和流动相

高效液相色谱法的固定相

要求：颗粒细且均匀、传质快、机械强度高、耐高压，化学稳定性好

液固：全多空硅胶、高庚子多空微球

应用最多的是化学键和相

常用化学键和相的种类和性质

1. 常用化学键和相的种类
   1. 非极性键合相：十八烷基硅烷（ODS）最常用。一般用于反相色谱。长链k大，载样量高，稳定性好。短链分离速度快，色谱峰对称性好，苯基键合与短链相似。
   2. 弱极性键合相：醚基和二羟基键合相，应用少
   3. 极性键合相：氨基、氰基，一般用于正相色谱。氰基分离选择性类似于硅胶，对双键有选择性，对双键异构体，或含双键数不同的环状化合物有较好分离能力。一些硅胶上不能分离的极性强的化合物也可在氰基上分离。氨基键合相与酸性硅胶有不同性能，氨基可与糖分子羟基选择性作用，从而分离糖。在酸性介质中还是弱阴离子交换剂，能分离核苷酸。但是与羰基反应
2. 键合相的性质和特点
   1. 键合反应：主要是硅氧烷型键合相，以氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应而制的
   2. 含碳量和覆盖度：键合相表面基团的键合量可以对键合硅胶进行元素分析，用含碳的百分数表示。覆盖度参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。在键合反应后用三甲基氯硅烷进行钝化处理，即封尾，减少对极性组分的吸附。
   3. 键合相特点：化学稳定性好，寿命长；均一性和重现性好；柱效高，选择性好；适于梯度洗脱；载样量大

其他种类固定相

1. 键合型离子交换剂：常用阳离子型键合相是强苏醒磺酸类；常用阴离子型键合相是季铵盐类；还有弱酸（碱）型离子交换剂
2. 手性固定相（CSP）：蛋白类、多糖类、环糊精、π-氢键型（刷型）、大环抗生素类、配体交换、其他。载样量小，稳定性差且价格昂贵。
3. 亲和色谱固定相：配基和载体间有一适当长度间隔臂

高效液相色谱法的流动相

要求：化学稳定性好；适宜溶解度；与检测器相适应；纯度高；粘度低

使用前经微孔滤膜过滤，除去固体颗粒，还要脱气处理

流动相对分离的影响

分离方程式：

选择合适的溶剂强度使组分k在最佳范围内，选择合适种类的溶剂改善选择性使α增大获得良好分离度R>1.5

溶剂极性和强度

在化学键和色谱中溶剂洗脱能力即溶剂强度直接与它的极性相关。

溶剂极性用溶剂极性参数表示，用以表示正相色谱中洗脱能力

反相键合相色谱溶剂强度用另一强度因子S表示

混合溶剂可以用P或S的加权平均表示

第三节：高效液相色谱速率理论和分离方法选择

高效液相色谱速率理论

柱内展宽

1. 涡流扩散：，λ为不规则系数，d_p为平均直径
2. 纵向扩散：，D_m与流动相粘度成反比，与温度呈正比，一般可以忽略
3. 传质阻抗：
   1. 固定相传质阻抗：键合相厚度可以囫囵，固定相传质阻抗可以忽略
   2. 流动相传质阻抗：，d_p固定相颗粒直径，D_m组分在流动相中扩散系数，ω有色谱柱及其填充情况决定
   3. 静态流动相传质阻抗：由于组分的部分分子是先进入滞留在固定相微孔内的静态流动相中，再与固定相进行分配，因而较晚回到流路引起色谱峰展宽。与d_p平方成正比，与D_m成反比，如果固定相微孔多且又深又小，峰展宽就越严重
   4. 注意两种粘度不同物质混合，其粘度不呈线性，一般选用低粘度洗脱剂

HPLC速率理论方程：

1. 固定相颗粒度对塔板高度影响：固定相颗粒粒度越小三个参数越小，所以减小d_p是保证HPLC高柱效的主要措施

柱外展宽

尽可能减小柱外死体积

高效液相色谱分离方法选择

（349页图）

第四节：高效液相色谱仪

高效液相色谱仪一般由高压输液系统、进样系统、色谱柱分离系统、检测系统和数据处理系统组成

高压输液系统

1. 高压输液泵：流量精度高，稳定；流量范围宽；能在高压下连续工作，液缸容积小；密封性能好，耐腐蚀
   1. 分为恒压泵和恒流泵
   2. 注意事项：防止固体微粒进入；流动相不含腐蚀性物质；防止溶剂瓶内流动相用完；不要超过规定最高压力；流动相先脱气
2. 梯度洗脱装置：分为低压梯度和高压梯度，低压梯度需要在线脱气装置

进样系统

1. 六通阀手动进样装置：重现性好，能耐高压
2. 自动进样装置：

色谱柱分离系统

1. 色谱柱：分为分析型和制备型。制备型柱内径大。内径根据柱长、填料粒径、折合流速确定，目的是避免管壁效应
2. 保护柱：装有与分析柱相同固定相填料的短柱，在色谱柱前，用来保护色谱柱
3. 柱温箱：
4. 色谱柱评价：色谱系统适用性试验

检测系统

检测器的功能

分类：

• 专属型：紫外、荧光
• 通用型：示差折光、蒸发光

要求：灵敏度高、噪声低、线性范围宽、重复性好、适用范围广

紫外检测器

紫外检测器UVD：不破坏样品，只能检测有紫外吸收物质、对流动相有限制

1. 可变波长检测器：氘灯/钨灯，但是单色光强度低
2. 光电二极管阵列检测器（PDAD或DAD）：同时检测多种波长

荧光检测器

荧光检测器FD：灵敏度更高，只适用于产生荧光物质，体内药物分析常用

安培检测器

电化学检测器ECD：极谱、库仑、安培、电导。电导用于离子检测，安培应用广泛，灵敏度高适用于痕量组分分析，凡是具有氧化还原活性的都能进行检测

蒸发光散射检测器

蒸发光散射检测器ELSD：适用于挥发性低于流动相的组分，用于糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、三酰甘油及甾体；对各种物质几乎有相同响应；但是灵敏度低，流动相必须是挥发性不能含有缓冲盐。

数据记录处理和计算机控制系统

仪器自动化：

采集和分析色谱数据：

中心计算机控制系统：

第五节：超高效液相色谱法简介

超高效液相色谱法UPLC：借助于HPLC理论及原理，利用小颗粒固定相，非常低的系统体积及快速检测手段等技术，使分离度、分析速度、检测灵敏度及色谱峰容量大大提高，从而全面提升了液相色谱的分离分析效能。

操作条件比较（355表）

优点：分析速度快；分离效能高；灵敏度高——小颗粒技术和整体化仪器设计

理论基础

van Deemter方程，可以发现固定相粒度越小，分离度越大。同时粒度越小，最佳流动相线速度越大，并有更宽优化范围，因此降低粒度可以提高分析速度。但是会增加系统柱压差，受到固定相机械强度和色谱仪系统耐压性限制

实现超高效液相色谱必要条件

1. 解决小颗粒固定相耐压问题
2. 解决小颗粒固定相装填问题，包括粒度分布及色谱柱结构
3. 超高压输液泵的使用
4. 使用低扩散、低交叉污染的快速自动进样器，配备针内进样探头和压力辅助进样技术
5. 高速检测器：优化流通池解决高速检测和扩散问题
6. 实现完善的系统整体性设计降低整个系统体积，特别是死体积，解决超高压下耐压及渗漏问题
7. 系统控制及数据管理，解决高速数据采集、仪器控制，此外还可实现超高效液相分析方法与高效液相分析方法的自动化

应用前景

• 高通量筛选
• 天然产物分析
• 蛋白质组学、基因组学、代谢组学
• 食品分析
• 环境分析

第六节：定性与定量分析方法

定性分析方法

1. 色谱鉴定法：
   1. 利用保留时间定性：调整流动相多次比较，没有保留指数可利用
   2. 利用加入标准对照品增加峰高定性：
2. 化学鉴定法：用专属化学反应对色谱分离后收集的组分进行定性分析
3. 色谱-光谱联用鉴定法：

定量分析方法

常用外标和内标，少用归一化。对药品中杂质含量测定常用主成分自身对照法

主成分对照法分为不加校正因子和加校正因子两种：

• 无杂质对照，不加校正因子，把供试样品稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，调整仪器灵敏度使对照溶液主成分峰高适当，然后取原溶液与稀释后溶液进样，以供试品溶液上各杂质峰面积有对照溶液主成分面积比较，计算杂质含量
• 加校正因子，需要有各杂质和主成分对照品，先测定杂质校正因子再以对照溶液调整仪器灵敏度，然后测定供试品溶液色谱上个杂质峰面积，分别乘以相对校正因子后于对照溶液主成分峰面积比较，计算杂质含量

注意进行色谱系统适用性试验：理论塔板数、分离度、拖尾因子和重复性