用R分析芯片实战（下）

刘小泽写于18.9.13
最近两天都在试着写GEO函数，想着做出来一起发送
但是好像没有那么简单，一步步正在调试

5 对结果进行注释～富集分析（基于超几何分布检验）

5.1 得到上调、下调基因

rm(list=ls())
load("GSE62832.DEG.Rdata")
DEG=DEG_mtx
if(T){
  logFC_cutoff <- with(DEG,mean(abs(logFC)) + 2*sd(abs(logFC)) ) 
  DEG$result = as.factor(ifelse(DEG$P.Value < 0.05 & abs(DEG$logFC) > logFC_cutoff,
                                ifelse(DEG$logFC > logFC_cutoff ,'UP','DOWN'),'NOT'))
}
gene <- rownames(DEG[DEG$result != 'NOT', ])

要再具体细分的话也可以

up_gene <- rownames(DEG[DEG$result =='UP',])
down_gene <- rownames(DEG[DEG$result =='DOWN',])

5.2 ID转换

使用clusterProfiler包接受的gene是Entrez ID，因此要先转换SYMBOL=》Entrez

几种主流的ID：

Ensemble id：由欧洲生物信息数据库提供，一般以ENSG开头，后边跟11位数字。如TP53基因：ENSG00000141510
Entrez id：由美国NCBI提供，通常为纯数字。如TP53基因：7157
Symbol id：为我们常在文献中报道的基因名称。如TP53基因的symbol id为TP53
Refseq id：NCBI提供的参考序列数据库：可以是NG、NM、NP开头，代表基因，转录本和蛋白质。如TP53基因的某个转录本信息可为NM_000546

library(clusterProfiler) 
library(org.Hs.eg.db)
if(T){
  gene_tr <- bitr(gene, fromType = "SYMBOL",
                  toType = c("ENSEMBL", "ENTREZID"),
                  OrgDb = org.Hs.eg.db)
  up_gene_tr <- bitr(up_gene, fromType = "SYMBOL",
                     toType = c("ENSEMBL", "ENTREZID"),
                     OrgDb = org.Hs.eg.db)
  down_gene_tr <- bitr(down_gene, fromType = "SYMBOL",
                       toType = c("ENSEMBL", "ENTREZID"),
                       OrgDb = org.Hs.eg.db)
  gene <- gene_tr$ENTREZID
  up_gene <- up_gene_tr$ENTREZID
  down_gene <- down_gene_tr$ENTREZID
}
head(gene_tr)
#结果发现：总体有3.07%没有对应，上调有2.13%没有对应，下调3.76%没有对应

转换完可以去检验一下，比如检查Entrez ID: 23336, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/23336。确实得到的是SYNM这个基因

5.3 进行KEGG注释

最常见的就是GO/KEGG数据库注释，根据clusterProfiler，每个注释就对应一个函数

富集分析使用超几何分布检验：
比如背景基因这里有18837个，选出来的差异基因（上调235个+下调319个）554个，约占总体3%；
目前KEGG 包含了530个pathway，其中一个04110是Cell Cycle通路，其中包含124个基因【怎么统计？打开链接-》https://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?hsa04110，找到gene栏-》使用linux cat命令变成一个列表 =〉wc】
如果是随机抽样的话，cell cycle在我们这554个基因中，应该能抽到124*3%=3个左右。也就是说，在得到的554个差异基因中，应该只有3个是cell cycle的基因；但结果找到了30个cell cycle的基因，那么就说明差异基因的产生都有cell cycle这个因素。如果是药物处理组的结果发现这样，就说明确实可能是药物起了作用，当然后续还需要结合其他分析
并非所有的通路都需要检测：有的通路比较小，只有十几个基因，我们这500多个差异基因中能抽到的理论上最多一个，这样一般就不考虑；还有的通路很大，有上千个基因，我们的背景基因才不到2w，那我们这586个差异基因中在这个pathway中的理论上就得有一百多个，这样理论和实际的变化差异就不明显，说明不了什么问题

enrichKEGG进行候选基因通路分析

if(T){
  kk <- enrichKEGG(gene         = gene,
                   organism     = 'hsa',
                   pvalueCutoff = 0.05)
  kk_gene <- (kk)[,1:6]
}
dotplot(kk,showCategory = 14,color="pvalue",font.size=14)  

enrichKEGG进行候选基因通路分析

按照包的说明做一个geneList（标准：Entrez ID对应logFC，然后logFC降序排列）

if(T){
  geneList <- DEG_mtx$logFC #先获得logFC【没有重复的18837个数值】
  names(geneList) <- rownames(DEG_mtx) #获得基因名，但这里是SYMBOL格式【也是没有重复的18837个名称】
  ##问题就出在（下一步）SYMBOL转Entrez名字上，会多出来许多的重复：如果只是SYMBOL转Entrez，那么会得到18841个名称，原因就是一个symbol对应多个entrez ID，用count(geneList_tr,geneList_tr$SYMBOL) %>% arrange(desc(n))这样来查看到底哪些基因，结果查到有4个基因对应了2个entrez ID，其中一个是“HBD”，然后使用filter(geneList_tr, geneList_tr$SYMBOL == "HBD")来看HBD对应了哪个ID，果然发现HBD对应了两个ID；如果将SYMBOL转ENSEMBL+Entrez，那么会得到20198个名称，因为同一个SYNBOL，同一个Entrez，会有不同的Ensembl ID
  #另外还有别人的友情提示：ENTREZID(具有唯一性）：基因编号来自ANNOVAR的注释结果，建议别用SYMBOL，因为这种名称特异性较差，在转成ENTREZID时可能出现不唯一的现象。symbol与entrezID并不是绝对的一一对应的
  geneList_tr <- bitr(names(geneList), 
                      fromType = "SYMBOL",
                      toType = c("ENSEMBL","ENTREZID"),
                      OrgDb = org.Hs.eg.db) 
  #下一步目的：将Entrez ID与logFC联系起来
  #因为转换后的名称已经不是和原来的geneList行名一一对应了，所以不能直接将原来SYMBOL行名变为Entrez ID。但是可以用SYMBOL名作为桥梁，一边连接logFC（做一个数据框），另一边连接Entrez ID（已经有的geneList_tr数据框），再将两个数据库按照SYMBOL联系起来
  new_list <- data.frame(SYMBOL=names(geneList), logFC = as.numeric(geneList)) 
  new_list <- merge(new_list, geneList_tr, by  = "SYMBOL")
  
  geneList <- new_list$logFC #重新生成geneList之logFC
  names(geneList) <- geneList_tr$ENTREZID #重新生成geneList之Entrez ID
  
  geneList <- sort(geneList,decreasing = T) #降序排列
}

gseKEGG GSEA分析

if(T){
  kk2 <- gseKEGG(geneList     = geneList,
                 organism     = 'hsa',
                 nPerm        = 1000,
                 minGSSize    = 120,
                 pvalueCutoff = 0.2,
                 verbose      = FALSE)
}
head(kk2)[,1:6]
gseaplot(kk2, geneSetID = "hsa04310")

hsa04310 GSEA分析

查看特定通路图

library(pathview)
hsa01212 <- pathview(gene.data  = geneList,
                     pathway.id = "hsa01212", #上述结果中的hsa01212通路
                     species    = "hsa",
                     limit      = list(gene=max(abs(geneList)), cpd=1))

特定通路图

5.4 进行GO注释

if(T){
#这里以细胞组分CC为例
  ego_CC <- enrichGO(gene          = gene,
                     universe      = names(geneList),
                     OrgDb         = org.Hs.eg.db,
                     ont           = "CC",
                     pAdjustMethod = "BH",
                     pvalueCutoff  = 0.01,
                     qvalueCutoff  = 0.05,
                     readable      = TRUE)
}
ego_gene <- head(ego_CC)[,1:6]
##可视化--点图
dotplot(ego_CC,title="EnrichmentGO_CC_dot")#点图，按富集的数从大到小的
##可视化--条形图
barplot(ego_CC, showCategory=20,title="EnrichmentGO_CC")#条状图，按p从小到大排，绘制前20个Term
#通路图
library(Rgraphviz)
library(topGO)
plotGOgraph(ego_CC)

GO点图

GO条形图

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