手术炎症促进肿瘤复发-乳腺癌术后加速肿瘤复发？

The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy，if=16.761，Sci Transl Med. 2018 Apr 11;10(436). pii: eaan3464. doi: 10.1126/scitranslmed.aan3464

背景

临床现象：乳腺癌原发灶切除术后，一大部分患者会在术后12-18个月出现远处复发，一般术后1-1.5年复发，称为同时性复发synchronous 。结直肠癌肝转移有同时性肝转移和异时性肝转移的定义，《结直肠癌肝转移诊断和综合治疗指南v2013》中，将直肠癌术后6个月内的发生的转移称为同时性肝转移，6个月异常定义为异时性肝转移。等到v2016版时，同时性肝转移(synchronous liver metastases)是指结直肠癌确诊前或确诊时发现的肝转移；而结直肠癌根治术后发生的肝转移称为异时性肝转移(metachronous liver metastases，又可分为"早期异时性肝转移"和"晚期异时性肝转移"。

关于乳腺癌术后1-1.5年复发的推测，有人说这是疾病的自然进展，也有人认为是手术刺激了肿瘤细胞的生长。乳腺癌是全身性疾病，在发病诊断时，已经有肿瘤细胞在远处种植了，有些患者肿瘤细胞长期处于静止状态，另外一些患者肿瘤细胞再次增生生长，具体是那些因素刺激了静止状态细胞的在生长？

题目里有三个关键词：手术引发的炎症反应、免疫控制的肿瘤细胞、肿瘤潜伏期的大鼠模型。手术后的炎症反应如何量化，有哪些biomarker？如何鉴定远处定植的肿瘤细胞，而且还是被免疫控制的呢？乳腺癌潜伏期的大鼠模型如何制备，模型怎么评价成功？验证炎症使远处肿瘤细胞生长的原因的逻辑如何安排？

动物模型的制备

Balb/c小鼠是最常见的乳腺癌动物模型，将D2A1乳腺癌细胞种植于Balb/c小鼠皮下，会形成乳腺癌移植瘤模型。GFP绿色荧光蛋白是有效刺激T细胞的抗原，通过基因工程制作能表达GFP的D2A1乳腺癌细胞，再皮下注射，产生的肿瘤细胞含有GFP会激活T细胞的免疫功能，肿瘤生长反而受到抑制。在免疫功能受损的NOD/SCID小鼠，种植D2A1-GFP瘤细胞，肿瘤生长并不受影响。NOD/SCID=nonobese diabetic/severe combined immunodeficient非糖尿病免疫功能严重缺陷小鼠。

为什么D2A1-GFP瘤细胞生长受到抑制，是针对GFP的T细胞的免疫杀伤在起作用吗？收集移植瘤模型中引流肿瘤淋巴液中的白细胞leukocytes，体外ex vivo将其与D2A1-GFP瘤细胞共培养，可以检测到白细胞释放大量IFN-γ，提示激活细胞免疫。IFN-γ是细胞免疫激活的标志物。这种细胞免疫需要CD8+细胞和GFP抗原结合起作用。中和抗体删除小鼠体内CD8+，肿瘤生长不受限制；GFP免疫耐受小鼠体内，CD8+不会识别GFP，移植瘤生长同样不受限制。（需要制备GFP转基因小鼠，在生殖细胞内即表达GFP，之后动物对GFP形成免疫耐受）。

上述方法制造的D2A1-GFP移植瘤模型，肿瘤长到一定程度会停滞，持续2-3周后发生排斥反应致肿瘤缩小。在停滞期考虑肿瘤生长和机体细胞免疫达到平衡状态，而这种平衡状态很容易被破坏，比如手术刺激。

手术应激如何实施及评价（没有评价）

重点放在切口愈合，教科书描述经典切口愈合：中性粒细胞和巨噬细胞首先聚集，之后纤维母细胞修复和血管形成。切开动物模型皮下，植入无菌聚乙酸乙烯海绵，即可产生经典伤口愈合模型，而且这种伤口愈合方法可以产生比较一致的biological response。如果是采取切除原发肿瘤的方法，创面和出血等刺激在每个动物模型都不完全相同。

分别取海绵植入7天和14天的细胞组织，观察早期的中性细胞和巨噬细胞和晚期的纤维血管。

之前的疑问：局部的炎症环境是否不利于肿瘤细胞的生长？答案是：局部的炎症环境，破坏了机体的免疫功能，免疫功能不能有效控制肿瘤细胞，反而促进肿瘤生长。不是不利于肿瘤细胞生长，而是不利于免疫细胞发挥功能了。将免疫原性肿瘤细胞D2A1-GFP注射至切口海绵处，肿瘤生长明显增大，而没有切口或注射至切口远处，肿瘤细胞生长相对较缓慢。

免疫原性瘤细胞注射至切口部位时，肿瘤生长明显加快。

局部手术切口炎症引发全身免疫反应受损

将手术切口和免疫原性的肿瘤细胞注射于Balb/c小鼠不同部位，模拟机体远处的潜伏肿瘤细胞，发现手术切口仍旧可以促进远处瘤细胞的生长，该作用主要是通过手术炎症抑制机体免疫功能发挥作用，因为在immunocompromised的NOD/SCID小鼠中，手术切口炎症并不能影响远处瘤细胞的生长情况。该部分实验首先是模拟手术切口，然后再注射D2A1-GFP瘤细胞，观察瘤细胞生长情况。

临床实际上首先由乳腺癌细胞的远处播散，然后再做手术，那么该次手术对术前那些播散的肿瘤细胞有没有影响。可以先在Balb/c小鼠体内注射D2A1-GFP瘤细胞，体内瘤细胞生长和免疫控制达到平衡，然后再模拟手术切口炎症，观察瘤体生长情况。结果同样显示肿瘤生长增加。

最后改变手术切口炎症造模方法，只给予小鼠皮肤切开缝合，炎症反应损伤更小。即使如此，仍然可以影响远处已达到免疫平衡状态的肿瘤细胞，使其生长增加。要证明手术引起的全身性炎症会促进远处肿瘤生长，分别选用了切口植入海绵和单纯切口等不同的炎症模型方法，多方面论证。

切口炎症和瘤体注射远离，仍然影响肿瘤生长，模拟临床先注射D2A1-GFP瘤细胞，然后在切口，促进肿瘤生长。

作者还选用了黑色素瘤细胞B16，制作B16-GVAX免疫原性肿瘤细胞，接种C57BL/6小鼠模型，同样观察到手术切口所引发的全身验证反应，可以促进瘤细胞的生长。

局部手术切口如何引发全身炎症反应，进而影响瘤体

教课书上关于切口愈合过程描述：伤口局部中性粒细胞和巨噬细胞穿透血管壁转移至伤口周围，释放趋化因子继续引导中性粒细胞和巨噬细胞转移，最终释放大量炎症因子。需要明确全身炎症因子情况。抽取模拟手术切口的小鼠血液，检测炎症细胞和细胞因子，发现中性粒细胞和炎性单核细胞增多，IL-6、G-CSF和CCL2增多，其中G-CSF和CCL2分别趋化中性粒细胞和单核细胞穿透血管壁。伤口引发的全身炎症和局部炎症基本相同。

哪一种肿瘤局部炎细胞tumor infiltrating cells（中性粒细胞和单核巨噬细胞）会影响肿瘤生长？分析移植瘤体内白细胞数量情况，发现CD8+ T细胞数量与瘤体大小呈反比、与D2A1-GFP瘤细胞数量成反比，而髓系来源的CD11b+与CD8+T呈反比，与D2A1-GFP呈正比，提示CD11b+可能对抗T细胞对肿瘤的杀伤作用。利用anti-Ly6G抗体可以删除小鼠体内的中性粒细胞，删除中性粒细胞之后并不影响肿瘤生长。而抑制单核巨噬细胞转入移植瘤后，瘤体生长受抑制，提示单核细胞是介导免疫抑制的元凶。其实单核细胞转入瘤体内转化为巨噬细胞，又称为肿瘤相关巨噬细胞tumor-associated-macrophages，TAM在其他文献报道中具有免疫抑制作用。

全身血液中炎症因子及细胞情况，在tumor infiltrating cells中CD11b+与瘤体呈正比，其中只有单核细胞会影响肿瘤生长

那么肿瘤相关巨噬细胞是否具有免疫抑制作用呢？检测D2A1-GFP移植瘤体内的肿瘤相关巨噬细胞，发现其表面PD-L1表达升高，升高的PD-L1可以和CD8+T细胞表面的PD受体结合，从而抑制CD8+T细胞的免疫杀伤作用。采用PD1抗体处理移植瘤小鼠，发现不管是切口炎症小鼠还是未切口炎症小鼠，CD8+杀伤作用增强，肿瘤明显缩小。提示免疫原性移植瘤是immuno controlled的肿瘤，其中PD-L1的低表达在其免疫控制中其重要作用。

控制手术切口引发的炎症反应，是否可以控制肿瘤的生长

上述数据已经提出相对完善的手术炎症导致肿瘤复发的大体机制，如果上述推断成立的话，给予美洛昔康抑制全身炎症反应，将会减轻肿瘤的复发或动物模型上的瘤体生长。查阅相关文献，确实有回顾性研究报道乳腺癌术后利用NSIADs类止痛药的患者，肿瘤复发率显著降低。只是文献中没有说明：是NSIADs止痛药直接具有肿瘤抑制作用，还是通过其他抑制炎症的机制抑制肿瘤。NSIADs究竟是通过哪种机制抑制肿瘤生长？作者所用的模型即可验证：D2A1-GFP移植瘤模型，分为手术炎症组和非手术组，给予美洛昔康抗炎后，观察哪组肿瘤生长受到抑制。手术组瘤体被抑制、非手术没有被抑制，则为抗炎机制；手术组瘤体被抑制，非手术同样被抑制，可能为直接抑瘤机制。

PD1抗体可以抑制肿瘤生长。接受美洛昔康抗炎治疗，手术组瘤体被抑制，非手术组没有被抑制，提示美洛昔康通过抑制炎症反应而抑制肿瘤的生长。

美洛昔康又是通过何种机制而影响肿瘤的生长呢？美洛昔康可以引起肿瘤浸润的巨噬细胞（tumor infiltrated TAM）表型改变，他可以抑制TAM表面CD206的表达，而CD206具有免疫抑制作用。但是同时美洛昔康会升高TAM表面的PD-L1，作者解释为TAM升高的PD-L1是机体肿瘤免疫增强的标志。

总结

乳腺癌是全身性疾病，诊断时已有大量癌细胞在原发灶之外定植，由于机体的CD8+T的免疫杀伤作用，远处定植的癌细胞一直处于CD8+T细胞的监视之下，两者处于动态平衡。直至手术切除原发肿瘤，引发全身炎症反应，大量单核细胞转移趋化至定植肿瘤细胞周围，转化为巨噬细胞，巨噬细胞表面的PD-L1可以抑制CD8+T的免疫杀伤作用。平衡被破坏，定植的肿瘤细胞爆发生长，远处肿瘤复发。如果围术期口服NSIADs抗炎镇痛药物，可以明显降低早期肿瘤复发。（NSAID analgesic ketorolac used perioperatively may suppress early breast cancer relapse: Particular relevance to triple negative subgroup.Breast Cancer Res. Treat.134, 881–888 (2012）Reduction of breast cancer relapses with perioperative non-steroidal anti-inflammatory drugs: new findings and a review.Curr Med Chem. 2013;20(33):4163-76）。