第十七章：色谱分析法概论

第十七章：色谱分析法概论

色谱分析法（chromatography）：利用物质在作相对运动的两相之间进行反复多次的分配过程而产生差速迁移，从而实现混合组分的分离分析的方法

固定相：

流动相：

色谱柱：

第一节：色谱法的分类

根据流动相与固定相物态：

• 流动相物态：气相色谱GC、液相色谱LC、超临界流体色谱SFC
• 固定相物态：固体、液体

按操作形式：

• 柱色谱、平面色谱（纸色谱、薄层色谱TLC、薄膜色谱）、逆流色谱

按色谱过程分离机制：

• 分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱、化学键和色谱、亲和色谱、手性色谱

按流动相驱动力：

• 气相色谱、液相色谱、毛细管电泳法CE、毛细管电色谱法CEC

第二节：色谱过程和色谱流出曲线

色谱过程

色谱过程是组分分子在流动相和固定相间多次分配的过程

色谱流出曲线

色谱流出曲线：经色谱柱分离后的各组分随流动相一次进入检测器，检测器将流动相中各组分浓度或质量的变化转变为可测量的电信号，记录此线好强度随时间变化的曲线称为色谱流出曲线，又称为色谱图

1. 基线：
2. 色谱峰：
3. 峰高h：
4. 标准差σ：正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半称为标准差，对于正常峰，σ为0.607倍峰高处的峰宽之半，衡量组分被洗脱出色谱柱的分散程度
5. 半峰宽W_1/2：峰高一半处的宽度
6. 峰宽W：通过色谱峰两侧拐点作切线，在基线上所截得的距离称为峰宽，也称为基线宽度，或
7. 峰面积A：色谱峰曲线与基线包围的面积称为峰面积，

第三节：色谱参数

相平衡参数

1. 分配系数K：在一等温度和压力下，组分在两相中达到分配平衡后，其在固定相与流动先中的浓度之比称为分配系数
2. 容量因子k：在一定温度和压力下，组分在两相中达到分配平衡后，其在固定相和流动相中质量之比称为容量因子，又称为质量分配系数或分配比

保留值（定性参数）

1. 保留时间t_R：从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔，主要用于柱色谱
2. 死时间t₀：不被固定相保留的组分从进样到其在柱后出现浓度极大时的时间
3. 调整保留时间：
4. 保留体积V_B：从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大时所需要通过色谱柱流动相体积
5. 死体积V₀：由进样器到检测器的流路中未被固定相占有的空间体积
6. 调整保留体积：与流速无关
7. 保留指数I：把组分的保留行为换算成相当于含有几个碳的正构烷的保留行为，通常是用与被测组分的保留时间相近的两个正构烷作为标准，来标定被测组分保留指数。认为赶顶正构烷烃的保留指数为其碳原子数100倍。

分离度

，一般

第四节：色谱法的基本原理

差速迁移

保留比

基本类型色谱法的分离机制

分配色谱法

1. 分配机制
2. 固定相和流动相：流动相极性弱于固定相，称为正相分配色谱
3. 洗脱顺序：

吸附色谱法

1. 吸附系数：
2. 固定相和流动相：固定相一般为硅胶、氧化铝、聚酰胺
3. 洗脱顺序：
   1. 影响因素：组分分子与流动相分子对吸附剂表面活性中心的竞争；组分分子的基团与吸附剂表面活性中心的氢键、偶极和诱导等作用；组分在流动相中的溶解性

离子交换柱色谱法

1. 分离机制：利用样品组分离子对离子交换剂的亲和能力的差别而实现分离，选择性系数与样品组分离子、离子交换剂、流动相性质有关
2. 固定相和流动相：固定相常用离子交换树脂（易膨胀、传质慢、柱效低、不耐压）化学键和离子交换剂（机械强度高、耐压、不溶胀、传质快、柱效高）
3. 洗脱顺序：受组分离子的电荷和水合离子半径、离子交换剂性质、流动相组成和pH影响。一般低价太离子先出；水合离子半径大先出；交换能力强选择性系数大的离子组成的流动相有较大洗脱能力；增加流动相离子强度也能增加洗脱能力；离子交换剂的交换能力越强，组分离子倍洗脱越慢；强离子交换树脂受pH影响较小，弱离子交换树脂受pH影响较大

分子排阻色谱法

1. 分离机制：柑橘被分离组分分子的线团尺寸不同即渗透系数不同而进行分离。固定相是多孔凝胶，又称凝胶色谱法。以有机溶剂为流动相称为凝胶渗透色谱法，以水为流动相称为凝胶过滤色谱法，分离机制与流动相性质无关。

   渗透系数：

2. 固定相和流动相：多孔凝胶。

   1. 排斥极限：当某高分子化合物的相对分子质量达到某一数值后就不能渗透进入凝胶的任何孔穴，这一相对分子质量称为排斥极限。小于某一书之后就能进入凝胶的所有孔穴，这一相对分子质量称为该凝胶的全渗透点。排斥极限和全渗透点之间的相对分子质量范围称为该凝胶的相对分子质量范围。
   2. 流动相必须能溶解旁品同时还必须能润湿凝胶

3. 洗脱顺序：组分按相对分子质量从大到小洗出

第五节：色谱法基本理论

塔板理论

内容：把色谱柱看作一个有若干踏板的分馏塔。被分离的混合物在每个踏板的间隔内，在相对移动的流动相与固定相间达到动态平衡，然后倍流动相携带从一块塔板转移至另一块踏板，再达到动态分配平衡。经过多次的平衡、转移，各组分按分配系数大小顺序，一次流出色谱柱。

理论假设：

1. 在柱色谱内一小段高度H内。祖坟可以在两相中瞬间达到动态分配平衡，H称为塔板高度
2. 分配系数在塔板内是常数
3. 流动相不是连续地而是间歇式进入色谱柱，且每次只进入一个塔板体积
4. 样品组分都先加在0号塔板上，且组分的纵向扩散可以忽略不计

质量分配和转移

经过N次分配平衡之后，各塔板内组分总含量符合二项式的展开式：

色谱流出曲线方程

c_max为极大值，也就是t_R处c的值

塔板数和塔板高度

塔板数：

在这里t_R即为L

由于色谱系统存在死体积，组分因此消耗的死时间与分配平衡无关扣除死体积或死时间的影响，用替换t_R。

缺点：与实际不符，没有瞬间达到分配平衡，没有考虑纵向扩散，无法解释柱效流动相速度的关系，不能说明影响柱效的主要因素。

速率理论

塔板高度的统计学意义

速率理论的塔板高度是柱内单位长度中组分分子离散的程度。

总的塔板高度等于各独立因素对塔板高度的贡献之和。H为单位柱长上组分分子总的离散度，是单个分子离散度的统计概念。

速率理论方程

，H为塔板高度、A表示涡流扩散系数、B表示纵向扩散系数、C表示传质阻抗系数、u为流动相线速度

1. 影响柱效的动力学因素：
   1. 涡流扩散：由于填料粒径大小不等，填充不均匀，使同一组分的不同分子经过多个不同长度的途径流出色谱柱
   2. 纵向扩散：由于浓度梯度的存在，组分相前后扩散，造成色谱峰展宽
   3. 传质阻抗：由于传质阻抗存在，组分不能在两相间瞬间达到平衡，结果使有些分子随流动相向前移动较快，而另一些分子则滞后，从而引起峰展宽。传质阻抗包括固定相传质阻抗和流动相传质阻抗。
2. 流速对柱效的影响：在较低速度时，纵向扩散项起主要作用，线速度增大，塔板高度降低，柱效升高；在较大线速度时，传质阻抗起主要作用，线速度增大，摊薄高度增高，柱效降低。因此，对应某一流苏，塔板高度有一极小值，这一流速称为最佳流速。

第六节：色谱法的发展概况

1. 色谱法历史
2. 色谱法的现状和发展趋势
   1. 新固定相：手性固定相、生物色谱固定相、整体柱技术、固定相粒径减小
   2. 新检测器：蒸发光散射检测器、电雾式检测器、新型半导体激光荧光检测器
   3. 新方法：电分离技术、微全分析系统、毛细管电色谱法
   4. 色谱技术联用：色谱光谱联用、色谱色谱联用