Duplex UMI-ctDNA测序技术

1.液体活检弥补组织检测的不足

同一癌种的不同患者，同一个肿瘤患者的不同治疗阶段、同一肿瘤组织的不同区域，肿瘤的生物学特征均存在一定的差异。液体活检既可以克服组织检测的异质性，又具有简便、安全、无创、实时等特点，尤其是对于无法进行手术或穿刺，又或者肿瘤位置导致取样困难的患者而言，液体活检是一项可以弥补组织检测局限性的方法，近年来在肿瘤靶向治疗、耐药监测的实时评估等方面发挥着重要的作用。

2.什么是ctDNA检测？

目前液体活检的靶标包括：游离的循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环RNA（ctRNA）和外泌体（携带有细胞来源相关的多种蛋白质，脂类，DNA，RNA等）。
ctDNA是肿瘤细胞在坏死、凋亡后释放的一种游离DNA（cfDNA），在血液中的半衰期短，可以实时反映肿瘤的动态变化。

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然而肿瘤患者体内的肿瘤细胞数量 远远低于正常细胞， cfDNA在血浆中的含量很低，而 ctDNA仅占 cfDNA的 0.1%~5%，且不同癌种，不同病程的肿瘤患者ctDNA在血浆中 含量差异较大，因此相比于组织检测，ctDNA的检测需要 更高的灵敏度和特异性。

3.为什么ctDNA检测需要更高的灵敏度？

目前用于ctDNA液体活检的技术主要有ARMS-PCR、数字PCR（ddPCR）和第二代测序（NGS）。
NGS能同时检测多个基因的多种不同变异形式，是应用最广泛的的基因检测技术。但由于NGS的实验流程技术较为复杂，在文库构建、目标区域捕获及测序过程中不可避免的会引入一些扩增和测序的错误，这些错误我们把它们叫做背景噪音，而ctDNA检测往往突变频率较低，受到背景噪音干扰较大，来自ctDNA样本中的低频突变往往淹没在背景噪音之中，造成假阴性或假阳性结果，这就限制了ctDNA检测的灵敏度和特异性。

4.如何提高ctDNA检测的灵敏度和特异性？

分子条形码技术（UMI）
分子条形码又称分子标签（Unique Molecular indentifier，UMI），它的原理就是给每一条原始DNA片段加上一段特有的标签序列，经文库构建及PCR扩增后一起进行测序。这样，根据不同的标签序列我们就可以区分不同来源的DNA模板，分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正的携带的突变，从而提高检测灵敏度和特异性。
①　2012年5月，Tim Forshew等人率先开发了基于分子标签的TAm-Seq方法。
②　2012年9月，Michael W. Schmitt等利用双链分子标签技术将错误率显著降低。它的技术原理如下：