基因组从头组装软件

从头组装- de novo assembly

指在不需要任何参考序列的情况下对某一物种进行基因组测序，然后将测得的序列进行拼接、组装，从而绘制该物种的全基因组序列图谱。

常用拼接算法：

• De Bruijn 图 ：
  1>. 是目前最常用的二代测序拼接算法。比较流行的拼接软件如 Velvet、Abyss 和 SOAP denovo 都使用该算法。 
  该算法将已经非常短的reads再分割成更多个kmer短序列（k 小于reads 序列 的长度），相邻的kmers序列通过（k-1）个碱基连接到一起（即每次只移 动一个位置），进而降低算法计算重叠区域的复杂度，降低内存消耗。
  2>. 传统的 Sanger 测序的 reads 较长（1000bp），数据量较少，精度较高，所有的组装算法都利用 reads 之间的重叠，通过公共路径的方法解决拼接问题。而新一代测序产生的数据 read 更短、覆盖度更高、序列精度较低，为此这种以reads为中心的方法面临海量计算的困境。de Bruijn图框架为处理高覆盖、短序列提供了很好思路。

基本步骤：

1. 将reads打断成长度为K的核酸片段，再用Kmer间 的overlap关系构建DBG；
2. 寻找最优路径（经过每个节点且仅经过一次）， 最优路径对应的碱基序列构成一个contig；
3. 通过PE reads 位置信息确定 contig之间的相对位置和方向，组装contig，填充contig之间的gap，得到 scaffold序列

常用短序列拼接软件：

（一）SPAdes:

主要用于基因组拼接，也可用于一、二、三代测序的混合组装；还可用于转录组从头组装（rnaSPAdes）和宏基因组拼接（metaSPAdes）

• 安装：

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1. 需要先按照Python：
   Anaconda是一个开源的Python发行版本，其包含了conda、Python等180多个科学包及其依赖项。提供了包管理与环境管理的功能，可以很方便地解决多版本python并存、切换以及各种第三方包安装问题。Anaconda利用工具/命令conda来进行package和environment的管理，并且已经包含了Python和相关的配套工具。
   conda 是开源包（packages）和虚拟环境（environment）的管理系统。

• Anaconda安装：

1>. wget https://repo.anaconda.com/archive/Anaconda3-5.2.0-Linux-x86_64.sh

2>. sudo sh ~/Biosofts/Anaconda3-5.2.0-Linux-x86_64.sh
（这里是已经将下载的Anaconda3-5.2.0-Linux-x86_64.sh移到了这个目录下，所以路径会有不同，注意一下）

3>. 输入第二个命令后会进入到会看到提示“In order to continue the installation process, please review the license agreement.”（“请浏览许可证协议以便继续安装。”），点击“Enter”查看“许可证协议”。

4>.在“许可证协议”界面将屏幕滚动至底，输入“yes”表示同意许可证协议内容。然后进行下一步。

5>. 安装过程中，提示：“Press Enter to confirm the location, Press CTRL-C to cancel the installation or specify an alternate installation directory”（按回车键确认安装路径，按'CTRL-C'取消安装或者指定安装目录）

6>. 当出现“Do you wish the installer to prepend the Anaconda install location to PATH in your /home//.bash_profile ”（你希望安装器添加Anaconda安装路径在/home//.bash_profile文件中吗？）
输入“yes”后，路径/home//.bash_profile中“”即进入到家目录后你的目录名。如果输入no后，则需要自己添加路径。

在这里我选择的是no，所以需要自己添加路径
7>. 添加路径：nano ~/.bashrc  末尾加入：  export PATH=/root/anaconda3/bin:$PATH
或者 直接echo 'export PATH=/root/anaconda3/bin:$PATH' >>~/.bashrc

8>. 使其生效：source ~/.bashrc

9>. 检查是否成功：conda --version（出现conda的版本的时候即成功）也可以输入conda list检查。

• Anaconda 配置Python 环境
  1>. 创建名为Python27或Python34的环境，并指定版本是2.7还是3.4
  conda create --name python27 python=2.7 -y
conda create --name python34 python=3.4 -y
  2>.conda info -e

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2. 安装SPAdes：

1. 下载安装包：wget http://cab.spbu.ru/files/release3.12.0/SPAdes-3.12.0-Linux.tar.gz
2. 建立相应目录：mkdir ~/Biosofts/spades
3. 解压缩：tar zvxf /media/sf_Linux/Biosoft/SPAdes-3.12.0-Linux.tar.gz -C ~/Biosofts/spades/
 ~/Biosofts/SPAdes-3.12.0-Linux/bin/spades.py -h
 echo ‘export PATH=~/Biosofts/SPAdes-3.12.0-Linux/bin:$PATH' >>
~/.bashrc
 source ~/.bashrc
 spades.py -h

3. 运行SPAdes：
   （1）简介：

• 输出数据：
  1 ---------- forward 数据；
  2 --------- reverse数据；
  12 --------后面接的文件是交叉融合（正向和反向在一起）的 paired 数据；
  s ---------unpaired reads的序列
• 参数：
  -o ----------------- 输出文件夹
  --sc ------------- 用于组装MDA (single-cell) data
  --meta -----------用于组装宏基因组
  --rna ----------- 用于组装RNA-Seq data
  --plasmid--------runs plasmidSPAdes pipeline for plasmid detection
  --iontorrent------用于组装IonTorrent data
  --test--------------runs SPAdes on toy dataset
  -h/--help----------输出使用方法
  -v/--version------输出版本
• 高级选项：
  --dataset -----------file with dataset description in YAML format
  -t/--threads----------线程数，默认是16个
  -m/--memory-------RAM limit for SPAdes in Gb (terminates if exceeded) [default: 250]
  --tmp-dir-----------directory for temporary files [default: /tmp]
  -k------------------k-mer的设置数，如果是多个，中间要以逗号隔开，必须为奇数且不能大于128，即最大设置数 为127 [default: 'auto']
  --cov-cutoff ------coverage cutoff value (a positive float number, or 'auto', or 'off') [default: 'off'

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拼接基因组有可能有多种数据：每种都不太一样

• 仅有一个 library 数据 (SE、PE、ME)
  SE：用法-1 file_name

• 有多个 paired-end library 数据
  PE：用法--pe{int}-1 -----编号为 int 的 library 的 forward 数据

• 有多个 mate-paired library 数据
  ME：--mp{int}-1 ------号为 int 的 library 的 forward 数据

• 有PACBIO 数据
  选用--pacbio 参数

• 有已拼接的Contig数据
  --trusted-contigs------ 输入可信度高的 contigs，用于 graph construction,gap closure 和 repeat resolution。
  --untrusted-contigs--------输入可信度较低的 contigs, 用于gap closure 和
  repeat resolution。

（二）Velvet

1. 使用步骤：

• 第一步是velveth利用数据构建一个hash表；
  用法：velveth directory hash_length {[-file_format][-read_type][-separate|-
  interleaved] filename1 [filename2 ...]} {...} [options]
  解释：
  output_directory----------输出文件夹的路径
  hash_length--------------设置Kmer的大小，kmer大小对于组装的结果影响比较大，下面是文件格式，
  file_format--------------支持的格式有fasta（默认）、fastq、bam等。
  reads_type选项--------short(默认)、shortpaired、short2、shortpaired2 …
  short10、shortpaired10、long、longPaired。
• 第二步是velvetg进行序列拼接
  用法：velvetg velvet_out -exp_cov auto -cov_cutoff auto -very_clean yes
  解释：工作的目录，即为上一步骤velveth中的输出文件夹。
  cov_cutoff选项 default：no removal 设置最低kmer覆盖度的值。
  -exp_cov 选项，default：no long or paired-end read resolution。 期望的kmer覆盖度。如果设置了auto，则该值为所有nodes的kmer覆盖度值的median值; 该值设置为auto，则同时自动设置-cov_cutoff为auto。如果对杂合基因组进行组装时，设置auto，却很难进行预测，组装结果肯定不好。auto适用于标准的基因组测序。
  scaffolding defautl：yes 是否要使用paired end信息进行scaffolds组装如果哪一个shortPaired为mate-pair library测序的结果，则需要指定该参数为yes。
  conserveLong default：no是否保留含有long reads的序列
  default: no 是否输出contig比对到参考序列的summary.
  clean default: no 是否删除所有的不能用于重新计算的中间文件
  very_clean default: no是否删除所有的中间文件（删除后不能重新计算）

2. 安装：
   sudo apt-get install velvet
3. 结果解释：
   contigs.fa 即为我们最终需要的拼接结果文件，长度2倍长于kmer的
   contigs。参数-scaffolding决定生成的该fasta文件是否包含scaffold序
   列。
   stats.txt 用于决定覆盖度cutoff的统计表
   PreGraph 初始的de vruijin图
   Graph2 最终的de bruijin图 关于该文件中内容的解释，请见velvet
   PDF manual。
   velvet_asm.afg AMOS兼容的组装文件，能用于AMOS基因组组装软
   件包
   Log velvet的运行记录。

序列拼接评价软件

（一）QUAST

1. 安装：
   下载： wegt https://sourceforge.net/projects/quast/files/quast-5.0.0.tar.gz/download
   解压缩安装： tar zvxf quast-5.0.0.tar.gz -C ~/Biosofts/

• 什么是Contig N50
  Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs。将所有的Contig长度相加，能获得一个Contig总长度。然后将所有的Contigs按照从长到短进行排序，如获得Contig 1，Contig 2，Contig 3...………Contig 25。将Contig按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到Contig总长度的一半时，最后一个加上的Contig长度即为Contig N50。举例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3 +Contig 4=Contig总长度*1/2时，Contig 4的长度即为Contig N50。Contig N50可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准。