如何寻找并设计ChIP-qPCR引物

如何寻找并设计ChIP-qPCR引物

引物设计的流程：

用到的工具：NCBI,UCSC网站（直接百度就可以找到官网了）

首先，确定目标区域的DNA（我是以做ChIP为例，寻找的是DNA引物模板）

原理：IP拉下来的是DNA，所以不用太考虑内含子和外显子的关系，可以直接根据DNA序列，设计引物

目的：设定H3K4 me3的阴性对照和阳性对照区域的序列

(一)

1：去[ENCODE](https://www.encodeproject.org/)上寻找乳腺癌细胞系的CHIP-SEQ的数据，点击细胞系（箭头）。还可以选择细胞系，也可以选择组织直接点进去。

图一：ENCODE的界面

图二：选择ChIP-seq数据，点击

图三：选择不同的参考基因组，然后选择histone

可以选择一个点击进去看，里面有详细的信息，点击右下角底下的visualize(可视化)，可以出来查看的具体信息。

图四：MCF-7的 H3K4me3具体信息

可以选择使用UCSC看

图五：选择可视化的browser

点击进去之后，ucsc的界面，里面有的信息很多，对于我这种初学者来说，关注的就是箭头指示的位置，如第一个是输入位置信息/基因名字，第二个是我们选择样本的H3K4me3的peak信息，第三个是7种细胞系的H3K4me3的情况。

图六：UCSC可视化界面

2：选择阴性对照和阳性对照的区域

以FBXO33为例，可以在搜索框中输入FBXO33的基因名，然后点击go,会出现它的位置，以及对应的富集区域。我们可以看到有H3K4me3的富集峰，则可以选择这段的序列设计引物了。如果是有peak信息且富集的程度非常强的话可以设计当成阳性对照，阴性对照找没有peak富集的地方。

图七：阳性对照的寻找

图八，阴性对照的区域选择

（二）

以上，是根据CHIP的数据进行了区域的确定，接下来可以根据区域DNA序列的信息，进行引物设计

1：之前从文献当做看到MUC6可以当阴性对照，在搜索框中输入MUC6，go

图八：UCSC搜索框

2：根据搜索的结果可以看到，有些地方有峰（图九），但是不是很明显，去挑一些完全没有峰的地方设计引物，当阴性对照（图十）

图九：MUC6的搜索结果，还是有区域有峰的

图十：选择没有峰的地方当做阴性区域

3：选择该区域，ctrl加选定该区域，可以放大

图十一：选择该区域，ctrl+加选定该区域，可以放大

选择view--->DNA

图十二：获取DNA序列

（三）

引物的设计：

进入NCBI------>BLAST------->PRIMER BLAST

第一个箭头是可以输入DNA序列，可以进行引物的设计，如我们可以把找到阴性对照的那段DNA序列复制粘贴进去，让其设计

第二个箭头是引物的验证（对已有的引物进行检验）

图十三：NCBI 引物Blast

图十四：Blast结果