转录组入门（4）：了解参考基因组及基因注释

作业要求
转录组入门(4)：了解参考基因组及基因注释
在UCSC下载hg19参考基因组，我博客有详细说明，从gencode数据库下载基因注释文件，并且用IGV去查看你感兴趣的基因的结构，比如TP53,KRAS,EGFR等等。
作业，截图几个基因的IGV可视化结构！还可以下载ENSEMBL，NCBI的gtf，也导入IGV看看，截图基因结构。了解IGV常识。

参考基因组准备

明确实验目的，依据实验目的选取参考基因组，参考博文：RNA-seq选择参考基因组
了解不同数据库基因组各种版本对应关系，参考博文：基因组各种版本对应关系
本文下载小鼠基因组：

• 下载UCSC数据
  点击Downloads，选择Genome Data ;点击Mammals，找到M_musculus,选择合适版本，进入Full data set下载chromfa.tar.gz（该文件是基因组文件的打包），或进入Data set by chromsome文件中下载各条染色体序列，在合并。
• 下载NCBI下genome中基因组数据：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/M_musculus/
• Ensembl中基因组数据下载：http://www.ensembl.org/info/data/ftp/index.html

参考基因组注释文件准备

GENCODE（http://www.gencodegenes.org/）中有小鼠基因组注释文件；
Data->Mouse->Release History : 找到对应我们先前下载的GRCm38版本，这儿下载M11，这个数据的对应版本是不断更新的；

GFF文件选择：

研究能够注释到染色体上面的基因选择位于CHR即可；研究染色体基因（包括注释或未注释到染色体上面的基因，未成功注释的原因很多，测序误差以及一些亚型之类的问题）选择ALL；
这儿我下载了ALL gene的GTF文件。
Wget ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M11/gencode.vM11.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf.gz

GTF文件与GFF文件

GFF（general feature format），这种格式主要是用来注释基因组；文件每一行注释一个对象（gene,exon,cds and so on）,每行包含9列，还有文件的预定义行。
GTF（gene transfer format），是GFF的第二个版本；前8列与GFF差不多，第9列变化较大。
GFF文件是由tab键隔开的9列构成：

1. seqname - name of the chromosome or scaffold; chromosome names can be given with or without the 'chr' prefix.
2. source - name of the program that generated this feature, or the data source (database or project name)
3. feature - feature type name, e.g. Gene, Variation, Similarity
4. start - Start position of the feature, with sequence numbering starting at 1.
5. end - End position of the feature, with sequence numbering starting at 1.
6. score - A floating point value.
7. strand - defined as + (forward) or - (reverse).
8. frame - One of '0', '1' or '2'. '0' indicates that the first base of the feature is the first base of a codon, '1' that the second base is the first base of a codon, and so on..
9. attribute - A semicolon-separated list of tag-value pairs, providing additional information about each feature.

GFF文件第9列：以多个键值对组成的注释信息描述，键与值之间用”=“，不同的键值用”;“隔开，一个键可以有多个值，不同值用“;”分割，都是以ID这个属性开始。

1 transcribed_unprocessed_pseudogene  gene        11869 14409 . + . gene_id "ENSG00000223972"; gene_name "DDX11L1"; gene_source "havana"; gene_biotype "transcribed_unprocessed_pseudogene"; 
1 processed_transcript                transcript  11869 14409 . + . gene_id "ENSG00000223972"; transcript_id "ENST00000456328"; gene_name "DDX11L1"; gene_sourc e "havana"; gene_biotype "transcribed_unprocessed_pseudogene"; transcript_name "DDX11L1-002"; transcript_source "havana";

GTF文件第9列：同样是标签与值配对的情况，但标签与值之间以空格分开，值用双引号括起来；不同属性之间用“；”分隔；开头必须是gene_id, transcipt_id两个属性；

X   Ensembl Repeat  2419108 2419128 42  .   .   hid=trf; hstart=1; hend=21
X   Ensembl Repeat  2419108 2419410 2502    -   .   hid=AluSx; hstart=1; hend=303
X   Ensembl Repeat  2419108 2419128 0   .   .   hid=dust; hstart=2419108; hend=2419128
X   Ensembl Pred.trans. 2416676 2418760 450.19  -   2   genscan=GENSCAN00000019335
X   Ensembl Variation   2413425 2413425 .   +   .   
X   Ensembl Variation   2413805 2413805 .   +   .

预定义行：
name- unique name to identify this track when parsing the file
description - Label to be displayed under the track in Region in Detail
priority - integer defining the order in which to display tracks, if multiple tracks are defined.

IGV的下载和使用：

IGV官网（http://software.broadinstitute.org/software/igv/home），下载windows版本。

IGV

文件夹中的 igv.bat是运行程序：

IGV运行后主页面：

参考基因组导入两种方法：
1） 可以从右上角选取物种与相应的版本，基因组自动下载；
2） genome -> Load Genome From Files加载下载好的基因组文件；

基因组注释文件导入：
基因组注释文件排序：Tool -> Run igvtools中sort进行排序，然后导入排序后的文件

比对文件（sam文件）查看：
Sam文件转换为bam文件：
$ tools view -bS file-o file
对file.bam进行sort，排序后文件file.sort.bam：
$ samtools sort file.bam file.sort
为bam文件创建索引：
$ samtools index file.sort.bam
导入bam文件，即可查看比对结果。

参考：
转录组入门（4）：了解参考基因组及基因注释
GFF/GTF File Format
RNA-seq选择参考基因组
基因组各种版本对应关系