Week 4 L7-8 筛选DNA复制基因 EMSA 蛋白纯化

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7.1 Genetic Screens and the E. coli Replication Genes

怎样发现DNA复制基因？通过基因突变的方式，筛选DNA复制基因

最终得到的是温度敏感型的DNA复制突变株

7.2 Replication Mutants Identified by Ts Screens

获得突变株

7.3Using the Identified Replication Mutants

获得突变株怎样使用？
克隆基因
对基因测序
过表达基因以获得蛋白
添加epitope tag protein的基因，例如HA、Myc、FLAG、V5。抗体免疫沉淀并获得与之结合的蛋白
生物化学互补分析，流程如下所示。利用该流程可以从dnaG突变株提取物开始，纯化出引物酶。

突变株+B就能获得活性

B进一步分离，发现突变株+B2也能弥补复制缺陷

继续纯化，发现B2b能弥补初始单突变体的缺陷

7.4 Protein Purification of the Mutant Proteins

怎样知道纯化完成了？直到活性不再增长。指标是比活性
使用比活性：活性单体数目/每毫克你纯化组分中的总蛋白量。例如每毫克加入突变株提取物的蛋白质能使多少皮摩尔的氚标记的胸腺嘧啶掺入DNA。
得到的蛋白越纯，比活性越高

7.5 Replication Initiation复制起始 in E. coli Cells

8.1 电泳迁移率实验 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

用于DNA binding assays。
优点是迅速、定量
缺点是很难确定结合的是什么序列

8.2Overcoming the Disadvantages of the EMSA

使用竞争性来观察特异性

8.3DNase I Protection Assay

DNase I 非序列特异性内切酶，可以在双链DNA的一条上制造一个缺口，另外一条是完整的
优点是可以定位结合的位点
缺点是比较慢

8.4 DNA解璇实验DNA Unwinding Assay

8.5 间接末端标记Indirect End Labeling

8.6模板结合分析法 Template Association Assay

可以监测多种蛋白与大片段DNA的结合
生物素-磁珠。找到与DNA结合的蛋白