Week5— 单碱基编辑技术

发展背景

随着ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因编辑技术的相继出现,基因编辑技术逐渐变得更加简便、 高效, 并被广泛应用于基因功能、动物模型、基因治疗等研究。但是目前的基因编辑技术(ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9)依赖于在靶位点诱导双链断裂,进而激活DNA修复机制,实现基因矫正的目的。DNA修复机制主要包括两种方式:一种是易错的非同源末端连接(non-homologous end-joining,NHEJ),容易引起随机插入和缺失(indel); 在同源模板存在的情况下,还可以激活同源重组修复(homology directed repair,HDR),尽管后一种修复方式的精确性高,但是,该方式在细胞中的同源重组修复效率低,约为0.1%-5%【基因编辑之“新宠”—单碱基基因组编辑系统】【Nature .533(7603): 420–424. doi:10.1038/nature17946】。因此,基于双链断裂的基因编辑技术不仅容易产生DNA片段插入和缺失,且可能会产生脱靶效应,最终影响靶基因的功能。而单碱基编辑技术的出现有效地克服了这一问题。

发展历程

2016年4月,David Liu 实验室在Nature杂志上第一次发表了不需要DNA双链断裂即可进行单碱基转换的基因编辑技术——即单碱基编辑技术(base editor,BE)。单碱基编辑技术基于无核酸酶活性的Cas9(dCas9)或Cas9切口酶(Cas9n)、胞嘧啶脱氨酶以及sgRNA形成的复合体,在不断裂DNA双链的情况下,直接对靶向位点进行精准编辑,实现了在一定的活性窗口内胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)到腺嘌呤(A)的单碱基转换。单碱基编辑技术的出现促进了点突变基因编辑的有效性和使用范围。

Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage
Nature . 533(7603): 420–424. doi:10.1038/nature17946


同年,日本科学家基于AID(activation- induced cytidine deaminase (AID))同源物PmCDA1和dCas9或Cas9n以及鸟嘌呤糖苷化酶抑制子UGI的融合,也开发了碱基编辑系统。我国科学家常兴研究组也在同年发现了DNA碱基编辑的新方法,他们开发了基于哺乳动物的靶向AID介导的核苷酸突变(TAM),通过把诱导抗体高频突变的胞嘧啶脱氨酶AID与核酸酶缺陷的Cas9蛋白(dCas9)融合,在sgRNA的引导下靶向结合在DNA上,使胞嘧啶和鸟嘌呤可以随机地向其他三个碱基转变。
Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems
K. Nishida et al., Science 10.1126/science.aaf8729 (2016).

Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells


2017年4月,David Liu 实验室对单碱基编辑技术做了两点改进,这一成果发表在Nature Biotechnology:
第一:针对常用的化脓性链球菌的Cas9(SpCas9)蛋白靶向范围较窄,只识别含有NGG或NGA的PAM(Protospacer adjacent motif)序列的靶位点的限制,David Liu 实验室通过使用金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)、SaCas9突变体(Sacas9-KKH)、SpCas9突变体(SpCas9-VQR,SpCas9-EQR、SpCas9-VRER)替代SpCas9, 从而识别含有NGG、NGA,NGAN,NGAG,NGGG,NNGRRT和NNNRRT的PAM序列,显著提高了单碱基基因编辑的靶向范围。
第二:由于单碱基编辑系统只能将在胞嘧啶脱氨酶活性位点附近的C脱氨基,胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1的活性窗口通常有5个核苷酸,会使活性窗口中非靶向的碱基也发生替换作用。针对这一限制,David Liu实验室通过对胞嘧啶脱氨酶进行突变,降低酶的活性、改变底物的结合和构象,或者直接降低底物进入胞嘧啶脱氨酶活性区域的能力,缩小了单碱基编辑系统的活性窗口,从5个核苷酸窗口缩小至1-2个核苷酸活性窗口。
Increasing the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions
Nat Biotechnol . 2017 April ; 35(4): 371–376. doi:10.1038/nbt.3803


2017年6月,David Liu实验室对碱基编辑进行了新的改进,他们通过对BE3引入突变来减少脱靶效应,产生了高保真的碱基编辑器(high-fidelity base editor,HF-BE3);并将BE3和HF-BE3作为核糖核蛋白(RNP)复合物纯化并输送到哺乳动物细胞中,建立无DNA碱基编辑。

Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery
Received 6 Feb 2017 | Accepted 27 Apr 2017 | Published 6 Jun 2017
Received 6 Feb 2017 | Accepted 27 Apr 2017 | Published 6 Jun 2017
DOI: 10.1038/ncomms15790

同年11月,David Liu实验室又报道了基于E. coli TadA(ecTadA)的腺嘌呤脱氨酶的新型单碱基编辑器——腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors (ABEs)),实现了A.T碱基对向G.C碱基对的转换。经过不断的改进,第7代的腺嘌呤碱基编辑器将靶向的A.T碱基转化为G.C碱基对可以达到约50%的效率(人类细胞),大于99.9%的纯度,并且引入插入或缺失的频率低于0.1%。
Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage
Nature. 2017 November 23; 551(7681): 464–471. doi:10.1038/nature24644.


单碱基编辑技术的应用

1)单碱基编辑技术在疾病治疗中的应用
Komor et al 利用BE系统在鼠星型胶质细胞纠正了阿尔兹海默疾病相关的突变-APOE4, 和鼠乳腺癌细胞系的TP53突变,第一次证明了BE系统在基因治疗方面的潜在应用。
Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A., and Liu, D.R. (2016). Pro- grammable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA
2) 动物模型方面的应用
BE系统,尤其是BE3被广泛用于动物细胞培养模型,鼠、酵母、斑马鱼、鼠胚胎等基因编辑。
3)在植物方面的应用


第5周 2018—06.18-06.23

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