tophat软件比对-实战（2018-05-29）

1 比对的是：使用idba_ud拼接的AER314-4raw_data基因组与转录组数据。

2 bowtie2做index（bowtie2使用conda安装）

安装

建索引：bowtie2-build AER314-4_scaffold.fa AER314-4_scaffold.fa

索引目录

3 reads mapping到参考基因组——tophat2软件：基于bowtie2(tophat安装见软件安装）

命令：tophat2 -p 12 -o AER314-4_output /home/test04/lyr/rna-seq/02align_out/AER314-4_scaffold.fa /home/test04/lyr/rna-seq/01data/YSH-qurRNA-42-314-4_L001_R1.fastq /home/test04/lyr/rna-seq/01data/YSH-qurRNA-42-314-4_L001_R2.fastq

4 然后就很顺利的跑出来结果了

使用公司服务器，12个线程，大概五个小时就跑完啦。

结果文件

5 cufflink

[   Cufflinks输出结果

cufflinks的输入文件是sam或bam格式。并且sam或bam格式的文件必须排好序。（The SAM file supplied to Cufflinksmustbe sorted by          reference position.）Tophat的输出结果sam或bam已经排好了序。针对其他的未排序的sam或bam文件采用如下排序方式：

sort -k 3,3 -k 4,4n hits.sam > hits.sam.sorted

1. transcripts.gtf

该文件包含Cufflinks的组装结果isoforms。前7列为标准的GTF格式，最后一列为attributes。其每一列的意义：

列数  列的名称  例子        描述

1    序列名    chrX        染色体或contig名; 2    来源      Cufflinks  产生该文件的程序名; 3    类型      exon        记录的类型，一般是transcript或exon; 4    起始      1          1-base的值; 5    结束      1000        结束位置; 6    得分      1000        ; 7    链        +          Cufflinks猜测isoform来自参考序列的那一条链，一般是'+','-'或'.';8    frame    .          Cufflinks不去预测起始或终止密码子框的位置; 9    attributes  ...      详见下

每一个GTF记录包含如下attributes：

Attribute      例子      描述

gene_idCUFF.1Cufflinks的gene id;transcript_idCUFF.1.1  Cufflinks的转录子 id; FPKM          101.267  isoform水平上的丰度,FragmentsPerKilobase of exon model perMillion mapped fragments; frac          0.7647    保留着的一项，忽略即可，以后可能会取消这个;conf_lo        0.07      isoform丰度的95%置信区间的下边界，即 下边界值 = FPKM * ( 1.0 - conf_lo );conf_hi        0.1102    isoform丰度的95%置信区间的上边界，即 上边界值 = FPKM * ( 1.0 + conf_hi ); cov            100.765 计算整个transcript上read的覆盖度;full_read_support  yes  当使用 RABT assembly 时，该选项报告所有的introns和exons是否完全被reads所覆盖

2. ispforms.fpkm_tracking

isoforms(可以理解为gene的各个外显子)的fpkm计算结果

3. genes.fpkm_tracking

gene的fpkm计算结果Cuffmerge简介

Cuffmerge将各个Cufflinks生成的transcripts.gtf文件融合称为一个更加全面的transcripts注释结果文件merged.gtf。以利于用Cuffdiff来分析基因差异表达。

2. 使用方法

$ cuffmerge [options]*

输入文件为一个文本文件，是包含着GTF文件路径的list。常用例子：

$ cuffmerge -o ./merged_asm -p 8 assembly_list.txt

3. 使用参数

-h | --help

-o  default: ./merged_asm

将结果输出至该文件夹。

-g | --ref-gtf将该reference GTF一起融合到最终结果中。

-p | --num-threads  defautl: 1

使用的CPU线程数

-s | --ref-sequence /该参数指向基因组DNA序列。如果是一个文件夹，则每个contig则是一个fasta文件；如果是一个fasta文件，则所有的contigs都需要在里面。Cuffmerge将使用该ref-sequence来帮助对transfrags分类，并排除repeats。比如transcripts包含一些小写碱基的将归类到repeats.  ]

cufflinks：

<1>命令：cufflinks -p 4 -o test_cuff /home/andengdi/lyr/rna-seq/02-align_out/test_output/accepted_hits.bam

流程及结果

5 用相同的方法将其他两个样本跑一遍。