BUSCO - 组装质量评估软件
BUSCO - Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs
额。直译的话就是普遍通用的单拷贝直系同源测试
文献
《BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs》
说明
BUSCO是一款使用python语言编写的对转录组和基因组组装质量进行评估的软件。在相近的物种之间总有一些保守的序列，而BUSCO就是使用这些保守序列与组装的结果进行比对，鉴定组装的结果是否包含这些序列，包含单条、多条还是部分或者不包含等等情况来给出结果。
BUSCO 软件根据OrthoDB 数据库，构建了几个大的进化分支的单拷贝基因集。将转录本拼接结果与该基因集进行比较，根据比对上的比例、完整性，来评价拼接结果的准确性和完整性。
BUSCO使用其他的工具搭建了流程，它的流程是
genoem assemble : tBLASTn --> Augustus --> HMMER3
Transcriptome : Find ORF --> HMMER3
Gene set : HMMER3
1. 下载与安装【方便】
这里使用conda来自动安装BUSCO以及它的依赖工具。如果没有conda，那么可以查看这篇文章安装conda。
安装conda之后进行busco的安装。安装完毕之后，下载好数据库文件就可以直接跳到运行那一步了。下面的配置啊，安装之类的是针对【麻烦】的安装方式。
conda install busco
有时候在默认搜索库中没有找到相关信息，那么就尝试下面的方法
# 构建conda的python3环境
conda create --name python36 python=3.6
# 然后激活
conda activate python36
# 执行安装
conda install -c https://conda.anaconda.org/bioconda busco
# 在使用完busco之后可以退出python36环境
conda deactivate
如果使用conda安装成功，那么就执行2. 下载数据库文件 -> 5. 运行 -> 6. 结果解读 -> 7. 画图
使用conda自动完整安装过程，但是有时候没有管理员权限或者其他一些原因无法这样安装，那么就可以根据下面的方法进行安装。
1. 下载与安装【麻烦】
不使用conda安装的话，那么每一个工具需要单独下载，然后导入到环境变量当中去，让busco想用到它们的时候能够找得到它们。在对这种关联软件安装折磨之后对程序的安装的理解有帮助的，加油！
依赖的工具
- Augustus
- HMMER
- Blast+
下载
- 下载软件包
# ============ 下载BUSCO ============
cd ~/Applications/download
wget -c https://gitlab.com/ezlab/busco/-/archive/master/busco-master.zip -O busco.zip
# ============ 下载依赖的工具 ============
# 下载Augustus
wget -c http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/binaries/augustus.current.tar.gz
# 下载HMMER
wget -c http://eddylab.org/software/hmmer/hmmer.tar.gz -O hmmer.tar.gz
# 下载Blast+
wget -c ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/LATEST/ncbi-blast-2.7.1+-x64-linux.tar.gz
安装
cd ~/Applications/download
# === 安装busco ===
unzip busco.zip
# 改名
mv busco-master busco
# 移动到外部
mv busco ../
cd ../busco
# 安装
python setup.py install
cd ~/Applications/download
# === 安装Augustus ===
tar -xzvf augustus.current.tar.gz
cd augustus-3.3.1
cd ../
mv augustus-3.3.1 ../
cd ../augustus-3.3.1
# 打开common.mk文件，将ZIPINPUT = true注释掉（即在最前面加一#号）
vim common.mk
# 安装
make
cd ~/Applications/download
# === 安装HMMER ===
tar -xzvf hmmer.tar.gz
cd hmmer-3.2.1
./configure
make
# === 安装blast+ ===
tar -xzvf ncbi-blast-2.7.1+-x64-linux.tar.gz
# 改名
mv ncbi-blast-2.7.1+ ../blast+-2.7.1-linux
# 删除安装包
cd ~/Applications/download
rm busco.zip
rm augustus.current.tar.gz
rm hmmer.tar.gz
rm ncbi-blast-2.7.1+-x64-linux.tar.gz
2. 下载数据库文件
上面软件安装完毕之后，就开始下载数据库文件了，根据组装的物种来选择对应的数据库文件。
# 浏览器打开下列网址
https://busco.ezlab.org/
查找下载需要评估的组装的物种对应的类群（最近：最近发现了busco的库更新了，里面的数据库的分类更加详细了，但是大类还是下面5个，具体的详细类别这里就不列举了）
- Bacteria 细菌
- Protists 原生生物
- Metazoa 后生动物
- Fungi 真菌
- Plant 植物
例如下载植物的BUSCO的数据库（对着需要下载的类群的图片右键->复制链接地址，之后就得到了下载链接，然后在命令行使用wget之类的下载命令下载），比如下面我下载的是植物相关的，我就下载的植物类群。
mkdir -p ~/database/BUSCO/
cd ~/database/BUSCO/
# 下载
wget -c https://busco.ezlab.org/datasets/embryophyta_odb9.tar.gz
# 解压文件
tar -xzvf embryophyta_odb9.tar.gz
下面在执行那一步对应的数据库的文件路径就是
~/database/BUSCO/embryophyta_odb9
3. 配置
这里配置是必须的，这一步需要仔细一些，路径出错的话是无法通过busco的检测的，在安装好软件之后 ~/Applications/busco/config/之中并没有config.ini文件，只有一个config.ini_default文件，可以把里面的内容复制下来，
- 方法1
新建一个config.ini文件或者直接复制一份
cp config.ini_default config.ini
- 方法2
也可以按照下面的说明进行
# 增加配置文件
vim ~/Applications/busco/config/config.ini
加入如下内容
# BUSCO specific configuration
# It overrides default values in code and dataset cfg, and is overridden by arguments in command line
# Uncomment lines when appropriate
[busco]
# Input file
;in = ./sample_data/target.fa
# Run name, used in output files and folder
;out = SAMPLE
# Where to store the output directory
# out_path = /workdir
# Path to the BUSCO dataset
;lineage_path = ./sample_data/example
# Which mode to run (genome / protein / transcriptome)
;mode = genome
# How many threads to use for multithreaded steps
;cpu = 1
# Domain for augustus retraining, eukaryota or prokaryota
# Do not change this unless you know exactly why !!!
;domain = eukaryota
# Force rewrite if files already exist (True/False)
;force = False
# Restart mode (True/False)
;restart = False
# Blast e-value
;evalue = 1e-3
# Species to use with augustus, for old datasets only
;species = fly
# Augustus extra parameters
# Use single quotes, like this: '--param1=1 --param2=2'
;augustus_parameters = ''
# Tmp folder
;tmp_path = ./tmp/
# How many candidate regions (contigs, scaffolds) to consider for each BUSCO
;limit = 3
# Augustus long mode for retraining (True/False)
;long = False
# Quiet mode (True/False)
;quiet = False
# Debug logs (True/False), it needs Quiet to be False
debug = True
# tar gzip output files (True/False)
;gzip = False
# Force single core for the tblastn step
;blast_single_core = True
[tblastn]
# path to tblastn
path = ~/Applications/blast+-2.7.1-linux/bin
[makeblastdb]
# path to makeblastdb
path = ~/Applications/blast+-2.7.1-linux/bin
[augustus]
# path to augustus
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/bin
[etraining]
# path to augustus etraining
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/bin
# path to augustus perl scripts, redeclare it for each new script
[gff2gbSmallDNA.pl]
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/scripts
[new_species.pl]
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/scripts
[optimize_augustus.pl]
path = ~/Applications/augustus-3.3.1/scripts
[hmmsearch]
# path to HMMsearch executable
path = ~/Applications/hmmer-3.2.1/src
[Rscript]
# path to Rscript, if you wish to use the plot tool
path = /usr/bin/
在新建好config.ini文件之后，
将
config.ini文件中的out_path = /workdir前面加上#
因为这个工具的输出路径有时候会出错，所以干脆将它注释掉，之后假如运行busco之后，输出的路径就是你之前cd到的路径之后一般需要改这几项对应的路径（里面的路径需要更改为你自己的工具的路径）
| 选项 | 相关 |
|---|---|
| [tblastn] | blast+ |
| [makeblastdb] | blast+ |
| [augustus] | Augustus |
| [hmmsearch] | HMMER |
| [gff2gbSmallDNA.pl] | Augustus |
| [new_species.pl] | Augustus |
| [optimize_augustus.pl] | Augustus |
| [hmmsearch] | HMMER |
这些就是刚才我们安装的blast+和HMMER和Augustus的执行文件的路径，只需要把前面的路径改为你安装的程序的位置的路径就可以啦！
比如我的blast+是安装在
~/Applications之下， 执行文件在~/Applications/blast+-2.7.1-linux/bin之中，比如你是安装在~/NAME/biosofts下面，那么对应的执行文件的路径就是~/NAME/biosofts/blast+-2.7.1-linux/bin。
其实可以看到上面的都是一些路径或者默认选项设置，读取配置文件然后设置这些项目进入程序是很多工具的方式。
4. 导入环境变量
这里没有对软件进行完整的安装，所以需要导入临时环境变量（防止在配置文件中busco没有找到相关程序）
下面的路径都是刚才安装的程序的对应的路径
# augustus工具的执行文件所在文件夹
export PATH="/home/ssd/Applications/augustus-3.3.1/bin:$PATH"
# augustus工具附加脚本所在文件夹
export PATH="/home/ssd/Applications/augustus-3.3.1/scripts:$PATH"
# augustus工具配置文件的所在位置 。AUGUSTUS_CONFIG_PATH 需要使用绝对路径
export AUGUSTUS_CONFIG_PATH="/home/ssd/Applications/augustus-3.3.1/config"
# hmmer工具的执行文件所在文件夹
export PATH="/home/ssd/Applications/hmmer-3.2.1/src:$PATH"
# blast+工具的执行文件所在文件夹
export PATH="/home/ssd/Applications/blast+-2.7.1-linux/bin:$PATH"
[可选]如果经常使用，建议加入永久的环境变量
# 打开.bash_profile文件
vim ~/.bash_profile
# 在末尾添加上面的导入环境变量的内容
5. 运行
开始评估
基本的使用方法为
run_BUSCO.py -i [组装的文件.fasta] -l [数据库文件夹] -o [输出文件名] -m [评估模式] [其他一些选项]
实际使用例子，如果是使用conda安装的BUSCO的话。执行的时候不需要写完整的路径，只需要写run_BUSCO.py。
# 首先cd到对应的组装文件的文件夹
#
# -i 输入文件
# -l BUSCO的数据库文件
# -o 输出的文件名的后缀以及文件夹的名称
# -m 分析类型（genome、transcriptome、proteins）
# --cpu 线程数
~/Applications/busco/scripts/run_BUSCO.py \
-i contigs.fasta \
-l ~/database/BUSCO/embryophyta_odb9 \
-o suffix\
-m genome \
--cpu 8
⚠️注意：在fasta文件中，一些组装工具生成的contig的名字是这种形式的>contig/1/12345之类的，这种fasta文件在运行的时候BUSCO会报错，解决办法就是将这种改名，老办法，perl单行程序。
cat contig.fasta | perl -p -e 's{/}{}g' > contig.new.fasta
6. 结果解读
在运行文件夹下会有
-
run_suffix文件夹：因为上面-o选项设置了suffix，所以文件夹名称加上了后缀。在这个文件夹里面，有一个文件最为重要。就是short_summary_suffix.txt,
下面是个范例
# Summarized benchmarking in BUSCO notation for file assembly/spades/contigs.fasta
# BUSCO was run in mode: genome
C:98.6%[S:98.6%,D:0.0%],F:0.0%,M:1.4%,n:148
146 Complete BUSCOs (C)
146 Complete and single-copy BUSCOs (S)
0 Complete and duplicated BUSCOs (D)
0 Fragmented BUSCOs (F)
2 Missing BUSCOs (M)
148 Total BUSCO groups searched
| 缩写 | 全称 | 说明 | 关系 |
|---|---|---|---|
| C | Complete | 多少个BUSCO测试基因被覆盖。 | C = S + D |
| S | single-copy | 多少个基因经过比对发现是单拷贝。 | - |
| D | duplicated | 多少个基因经过比对发现包含多拷贝。 | - |
| F | Fragment | 多少个基因经过比对覆盖不完全，只是部分比对上。 | - |
| M | Miss | 没有得到比对结果的基因数 | - |
| Total | Total | 总共测试的基因条目数 | Total = C + F + M |
下面列举了三种比对的情况。
- 情况1 - 完全覆盖
说明: +表示组装得到基因序列 -表示用于测试的基因序列
组装 : ================+++++++==============
测试 -------
或者
组装 : ==============+++++++++++============
测试 -------
- 情况2 - 部分覆盖
组装 : ================+++++++==============
测试 -----
/ \
或者
组装 : ================+++++++==============
测试 -------
/ \
- 情况3 - 没有比对
组装 : ================+++++++==============
测试
一般来看S + D的数值也就是C的值越大越好，但是在文献中作者说如果D的数值太多的话可能意味着组装错误的可能性较大。因为一个基因（BUSCO数据库中该基因一般为单拷贝）被覆盖多次，那么可能就是说该基因所在的片段组装可能出现问题。
因为理论上
理论上：--------------------------------------------
实际上：-------- ---------- ---------- -----
错误的：-------- -------------
\\\\ ///
----------- --------------
理论上组装之后各个片段之间应该前后有序，之间除了重复区域或者其他特殊片段之外不应该有可以重叠的地方。
例如
sequence1 : ..TAGTCGTGA GTGCATGCTGTAGC..
\ /
AAAATTGG......CGATGAAAA
/ \
sequence2 : ..GGGTAGCGG TTGACTAGCTAGCT..
也就是说中间一段序列是两个序列的共同部分，除非这个序列存在多个拷贝，否则就很可能是拼接错误。通常一般这种拼接错误的序列的两端会出现重复序列。另外如果是多倍体组装的话，D值也可能大。
一般来看，S似乎越大越好，M越小越好，说明组装的越完整，因为检测的单拷贝同源基因出现得多。但是D与F这两个数值越大不见得就是好的，因为组装的错误可能会带来这两个值的增大。不能仅仅只是通过这一个软件来判定。比如还可以借助QUAST和常规指标N50、总的核酸量、点阵图等等多个辅助标准来进行综合的评估。
7. 画图
在执行完毕之后，可以使用generate_plot.py画图，这个图形说白了就是一种条形图。
- 首先把所有的经过BUSCO检测的结果聚集到一个文件夹之内
mkdir my_summaries
cp run_SPEC1/short_summary_SPEC1.txt my_summaries/.
cp run_SPEC2/short_summary_SPEC2.txt my_summaries/.
cp run_SPEC3/short_summary_SPEC3.txt my_summaries/.
cp run_SPEC4/short_summary_SPEC4.txt my_summaries/.
cp run_SPEC5/short_summary_SPEC5.txt my_summaries/.
- 然后运行
python scripts/generate_plot.py –wd my_summaries
这个图就是将刚才第6步中的那五个数值变成这种条形图显示，让这种多少的对比更加明显，当然了，你自己也可以使用正则表达式将数值抓取出来，之后输出到文件中，然后使用python或者R来画图也是可以的。
参考
- 基因课-使用BUSCO评价转录本拼接的质量
- 「干货集市」使用BUSCO评估基因组组装完整性
- Augustus安装
- hmmer的安装与使用
- Blast+安装和简单使用
- BUSCO手册
- Installing Augustus with manual bamtools installation
- Augustus install mac
- Installing Augustus with manual bamtools installation
Augustus安装错误
这种问题在Mac上安装出现的可能性比较大
y
cd auxprogs && make
make[1]: Entering directory '/home/jxyue/Tools/augustus-3.2.3/auxprogs'
cd bam2hints; make;
make[2]: Entering directory '/home/jxyue/Tools/augustus-3.2.3/auxprogs/bam2hints'
g++ -Wall -O2 -c bam2hints.cc -o bam2hints.o -I/usr/include/bamtools
bam2hints.cc:16:27: fatal error: api/BamReader.h: No such file or directory
#include
^
compilation terminated.
Makefile:29: recipe for target 'bam2hints.o' failed
make[2]: *** [bam2hints.o] Error 1
make[2]: Leaving directory '/home/jxyue/Tools/augustus-3.2.3/auxprogs/bam2hints'
Makefile:7: recipe for target 'all' failed
make[1]: *** [all] Error 2
make[1]: Leaving directory '/home/jxyue/Tools/augustus-3.2.3/auxprogs'
Makefile:7: recipe for target 'all' failed
make: *** [all] Error 2
解决方法
第一步：安装好bamtools
- 简单的安装方法
brew install bamtools libbamtools-dev
- 其他安装方法
git clone git://github.com/pezmaster31/bamtools.git
mkdir build
cd build
cmake -DCMAKE_INSTALL_PREFIX=/your/path/to/bamtools ..
make
make install
第二步：修改路径
- bam2hints Makefile
# 先进入到augustus的解压目录
cd ~/Application/augustus-3.2.3/auxprogs/bam2hints
vim Makefile
# ====== 修改下列值 =====
# 原始
INCLUDES = /usr/include/bamtools
# 修改
INCLUDES = $(BAMTOOLS)/include/bamtools
# 原始
LIBS = -lbamtools -lz
# 修改
LIBS = $(BAMTOOLS)/lib64/libbamtools.a -lz
- filterBam Makefile
cd ~/Application/augustus-3.2.3/auxprogs/filterBam/src/
vim Makefile
# ====== 修改下列值 =====
# 原始
BAMTOOLS = /usr/include/bamtools
# 修改
# BAMTOOLS = /usr/include/bamtools
# 原始
INCLUDES = -I$(BAMTOOLS) -Iheaders -I./bamtools
# 修改
INCLUDES = -I$(BAMTOOLS)/include/bamtools -Iheaders -I./bamtools
# 原始
LIBS = -lbamtools -lz
# 修改
LIBS = $(BAMTOOLS)/lib64/libbamtools.a -lz
安装
make BAMTOOLS=$(which bamtools)
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