Nature发文：CRISPR重大突破，有望实现临床应用！

最近，在纽约由哈佛医学院和马萨诸塞州总医院研究员Keith Joung领导的一个国际研究团队开发了一种高度灵敏的方法，可以有力地识别CRISPR-Cas核酸酶在体内的全基因组目标效应。

这项研究成果发表在《Nature》上，为促进开发使用基因编辑核酸酶的治疗策略提供了蓝图。

研究人员描述了“体内离体目标的验证”，并演示了使用它和一种故意设计成杂乱无章的引导RNA即CRISPR-Cas核酸酶，在小鼠肝脏中诱发大量的非靶点突变。他们还利用VIVO实验证明，适当设计的引导RNA可以在没有检测到非目标突变的情况下有效地编辑小鼠体内肝脏基因。

该研究思路包括初始的体外发现步骤，其中核酸酶的潜在非目标切割位点的超集通过使用测序或CIRCLE-seq方法在体外报告切割效应的循环来识别。第二步涉及体内确认，其中通过CIRCLE-seq鉴定的位点被检测为已用核酸酶处理的目标组织中的indel突变。

为了测试VIVO，研究人员设计了针对小鼠Pcsk9基因的化脓性链球菌Cas9引导RNA，他们预期该RNA在小鼠基因组中具有很高的诱导多重非目标突变的可能性。在用这种混杂的gRNA-CRISPR复合物感染两株小鼠后，研究人员用VIVO测定它在一株小鼠中造成3107个非靶切割位点，而在另一株小鼠中造成2663个非靶切割位点。

为了进行VIVO的第二步，研究人员随后评估他们鉴定的非目标切割位点是否显示小鼠肝脏体内有吲哚类化合物的证据。在他们检查的45个位点中，有19个显示了有吲哚类化合物的显著证据。这些数据向研究人员表明，Cas9与混杂的gRNA可在体内产生稳定或高频率的非靶突变，并且即使它们以低频出现，VIVO在识别这些非靶效应方面也是有用的。

但是因为潜在的治疗应用不会使用混杂的gRNA，所以研究小组随后试图评估被设计为更具针对性的Cas9 gRNA的体内非靶谱，因此他们构建了另外两个针对小鼠Pcsk9的gRNA。

他们再次使用VIVO来检查非目标效应，但是这次在两只小鼠中，在181个由CIRCLE-seq识别的潜在非目标位点中没有发现显著的非目标索引。为了进一步排除CIRCLE-seq错过任何非目标位点的可能性，研究人员还对在CIRCLE-seq实验中未被鉴定、在任何情况下未观察到显著指标的小鼠基因组中最接近的位点进行了有针对性的扩增测序。

“据我们所知，我们的报告首次证明了CRISPR-Cas核酸酶在体内可以强有力地诱导非靶点突变。先前的体内研究报告没有或很少有非靶点突变，但使用测序(GUIDE-seq)方法或硅胶方法中的其它方法实现的基于细胞基因组范围的双链断裂无偏鉴定，这些方法尚未被证实可有效鉴定”作者写道。

相比之下，即使是那些突变频率低至约0.13%的位点，VIVO也能够在体内对非靶位点进行灵敏的鉴定。CIRCLE-seq的高灵敏度很可能是能够识别所有潜在非靶位点的超集，包括那些在体内实际突变的位点。”

参考资料：CRISPR Researchers Develop Highly Sensitive Method for Identification of Off-Target Effects In Vivo | GenomeWeb（图片引自文献）

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