无参（De novo）转录组分析流程

1.先进行R包的安装：

source("http://bioconductor.org/biocLite.R")

< biocLite()

< biocLite("edgeR")

< biocLite("ctc")

< biocLite("Biobase")

< biocLite("ape")

< install.packages("gplots")

2.通过连接下载数据并解压：

$ wget http://sourceforge.net/projects/trinityrnaseq/files/misc/Trinity NatureProtocolTutorial.tgz/download

$ tar –xvf TrinityNatureProtocolTutorial.tgz

3.分别将解压后的左端reads和右端reads合并为一个文件，并利用Trinity进行转录组合成：

$ cat 1M_READS_sample/*.left.fq > reads.ALL.left.fq

$ cat 1M_READS_sample/*.right.fq > reads.ALL.right.fq

$ Trinity --seqType fq --left reads.ALL.left.fq --right reads.ALL.right.fq --SS_lib_type RF --CPU 6 --max_memory 20G

Trinity默认的输出结果为：trinity_out_dir/Trinity.fasta。用于下一步的分析

3.利用RSEM对转录本进行表达量的估计（Abundance Estimation）：

# RSEM for ds

$align_and_estimate_abundance.pl --seqType fq --left RNASEQ_data/Sp_ds.left.fq.gz --right RNASEQ_data/Sp_ds.right.fq.gz --transcripts trinity_out_dir/Trinity.fasta --est_method RSEM  --aln_method bowtie --trinity_mode --prep_reference --output_dir Sp_ds.RSEM

# RSEM for Sp_hs

$align_and_estimate_abundance.pl --seqType fq --left RNASEQ_data/Sp.hs.1M.left.fq --right RNASEQ_data/Sp.hs.1M.right.fq --transcripts trinity_out_dir/Trinity.fasta --est_method RSEM  --aln_method bowtie --trinity_mode --prep_reference --output_dir Sp_hs.RSEM

# RSEM for Sp_log

$align_and_estimate_abundance.pl --seqType fq --left RNASEQ_data/Sp.log.1M.left.fq --right RNASEQ_data/Sp.log.1M.right.fq --transcripts trinity_out_dir/Trinity.fasta --est_method RSEM  --aln_method bowtie --trinity_mode --prep_reference --output_dir Sp_log.RSEM

# RSEM for Sp_plat

% $align_and_estimate_abundance.pl --seqType fq --left RNASEQ_data/Sp.plat.1M.left.fq --right RNASEQ_data/Sp.plat.1M.right.fq --transcripts trinity_out_dir/Trinity.fasta --est_method RSEM  --aln_method bowtie --trinity_mode --prep_reference --output_dir Sp_plat.RSEM

生成abundance estimation information表达量估计信息文件

Sp_ds.RSEM / RSEM.isoforms.results （因为是对转录本的估计）

Sp_hs.RSEM / RSEM.isoforms.results

Sp_log.RSEM / RSEM.isoforms.results

Sp_plat.RSEM / RSEM.isoforms.results

对基因估计则会用到：RSEM.genes.results

4.生成数量矩阵（counts matrix），进行样本的统一化（erform cross-sample normalization）

abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM --out_prefix Trinity_trans Sp_ds.RSEM/RSEM.isoforms.results Sp_hs.RSEM/RSEM.isoforms.results Sp_log.RSEM/RSEM.isoforms.results Sp_plat.RSEM/RSEM.isoforms.results --name_sample_by_basedir

生成矩阵文件 Trinity_trans.isoform.counts.matrix

5.利用EdgeR差异表达分析：

run_DE_analysis.pl --matrix Trinity_trans.isoform.counts.matrix --method edgeR --dispersion 0.1 --output EdgeR

生成EdgeR文件夹

6.生成热图：

$analyze_diff_expr.pl --matrix ../Trinity_trans.isoform.TMM.EXPR.matrix -P 1e-3 -C 2

利用如下命令查看热图

% evince diffExpr.P1e-3_C2.matrix.log2.centered.genes_vs_samples_heatmap.pdf

7.生成聚类分析的图

$define_clusters_by_cutting_tree.pl --Ptree 60 -R diffExpr.P1e-3_C2.matrix.RData

利用如下命令查看图表：

% evince diffExpr.P1e-3_C2.matrix.RData.clusters_fixed_P_60/my_cluster_plots.pdf

文章引用：De novo RNA-Seq Assembly and Analysis Using Trinity and EdgeR

align_and_estimate_abundance.pl

补充一个DESeq2差异基因分析