基因组注释之同源搜索

1.在uniprot下载fungi蛋白质序列

在uniport数据库输入taxonomy:fungi AND reviewed:yes查找蛋白质相关数据，总共找到33905条序列，下载并解压。

蛋白质序列下载

2.创建本地数据库

使用makeblastdb程序，对上述FASTA格式的基因组序列进行处理，建立本地BLAST数据库。

/opt/BioBuilds/bin/makeblastdb -in GCA_000977205.2_Sc_YJM1338_v1_genomic.fna -input_type fasta -title yjm1338 -dbtype nucl -out yjm1338

3.全基因组的同源基因搜索

使用tblastn程序，把已知蛋白质序列和上述建立的本地BLAST数据库进行比对。

nohup tblastn -query uniprot-taxonomy%3Afungi+reviewed%3Ayes.fasta -db yjm1338 -out ./blastx_results.outfmt6 -evalue 1e-5 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -num_threads 10 &
nohup tblastn -query uniprot-taxonomy%3Afungi+reviewed%3Ayes.fasta -db yjm1338 -out ./blastx_results.outfmt7 -evalue 1e-5 -outfmt 7 -max_target_seqs 1 -num_threads 10 &

使用blast92gff3.pl和blast2gff.py程序，分别把结果转成GFF3格式
Python转化

python2 blast2gff.py -b blastx_results.outfmt6 -t gene -p sp -F >results_py.gff3

去除低质量的序列，共找到36367条序列

python转化

Perl转化

perl blast92gff3.pl -geneType gene -exonType exon blastx_results.outfmt6 > results_pl.gff3

perl转化

Python转化的结果不包含exon,当去除低质量的序列后，序列条数少于perl转化的结果。

4. 同源搜索结果的评估
   使用gffcompare工具把Perl转化后的结果与原始GFF格式数据进行比较，查看结果，并分析它们之间的异同之处。

./gffcompare -r file/GCA_000977205.2_Sc_YJM1338_v1_genomic.gff -o compare file/outresult6_pl.gff3

查看compare.stats结果

compare.stats

从compare.stats的结果看出碱基水平及基因水平结果比较好，外显子水平及转录本水平比较差，但可信度高；内含子结果差且可信度不高。从结果看出，同源搜索在预测结构方面并不是很好。

附录

关于Sensitivity和Precision

计算公式如下：
Sensitivity = TP / (TP+FN)
Precision = TP / (TP+FP)
例如，现在从一堆有好有坏的西瓜中挑好瓜，好坏各50个。二狗认为所有的都是好瓜，则TP、FP=50,则Sensitivity是100%，但这可信吗？很明显瓜中有坏瓜，所以不可信，此时需要考虑Precision，Precision=50%,而小明认为其中１个好瓜（这一个确实是好瓜），99个坏瓜，则,Sensitivity ＝1.96%,Precision＝100%，预测的好瓜特别对，但数量少。所以需要综合考虑Sensitivity和Precision 。