Enrichment Map User guide
译者：Y大宽
http://www.baderlab.org/Software/EnrichmentMap/UserManual#rnk
总概
CM可以使GSEA结果以网络化的形式可视化呈现。可以是GSEA的结果，当然也可以是DAVID,BINGO等其他的富集结果。Nodes代表基因集，edge代表每个set间的重叠。这种方式呈现的话，高度冗余的基因集会被划为一组叫clusters，这样就大大增强了导航和解释富集结果的准确性。基因富集是一种数据分析技术，需要有一下2个输入。
1.一个从基因组实验来的排列的基因列表
2.基因集，依据先验知识来的已经归类的功能基因集（如GO）或实验数据（如共表达模型）。
有了以上的输入，那么会输出一个基因集富集列表。也就是能更好的概况基因列表的基因集。通常gene-set enrichment 指的的功能富集，因为指定的功能基因集（如GO）是基于功能范畴的。如下图。
快速使用手册
生成EM（以下Enrichment Map简称为EM）
有几种选择：
加载GSEA结果
加载Generic 结果
加载David结果
加载Bingo结果
以上几种模式的唯一区别是富集列表的结构。如果要使用EM，需要以下文件
File.gmt：基因集 to gene ID
File.txt或.gct：表达谱矩阵（可选择）
File.txt或.xls（*）：富集列表（s）
（*）GSEA以.xsl格式保存富集列表，这不是真正的excel文件，而是修饰过的tab-separated文本文件，EM不能加载真正的EXCEL文件。
假如你的富集结果从GSEA产生的，主要从你的结果文件夹选择正确的文件即可，如果是用其他方法产生的富集结果，那你就去看下面的Full user guide，file 格式部分，确保文件格式和EM匹配。
另外，你可以选择参数缺省。如果你想自己设置自己的参数，那还是去Full user guide的参数选择部分。
EM****的地图
1.Nodes代表基因集
2.Edge代表相互重叠部分
3.富集显著性（p-value）以node颜色密度代表
4.富集的表型以node的颜色（hub）代表
Node在标准的2分类设计中，2个表型比较（比如处理组和非处理组，颜色hue代表富集表型。比如上调和下调的基因。如果两个表型中的一个作为参考（比如未处理），另外一个表型是感兴趣的。在这样的case中，在感兴趣的表型中富集意味up，在对照表表型中富集意味这down
5.Node size代表这个基因集中基因的数目。
探索****EM
1.窗口右边的results panel 的参数tab包含一些说明，比如表型颜色，还展示产生map的参数（比如cut-off值和data files）。
2.control panel面板中的左边network tab列出了当前session中所有可用的网络，底部有一个当前网络的总概，并可以方便的在网络中导航，甚至可以通过拖曳矩形框进行放大(当前窗口)。
3.点击一个node（代表一个基因集的圆圈）会打开data panel的（EM Geneset expression viewer）tab，显示选择基因集的所有基因的表达值的热图。
4.点击边（两个node之间的连线）会打开data panel的（EM overlap expression viewer）会显示被这个边连接的两个基因集中共有的所有基因的热图（也就是重叠基因）
5.如果同时选择了几个nodes和edges（可以通过拖曳感兴趣的基因集的box），那么EM geneset expression view会显示选中的基因集中的所有基因的union并且，EM overlap expression view会显示所有选中的基因集中共有的基因（也就是选中的几个基因集重叠基因）。
高级提示
1.对于大的网络和低放大水平的cytoscape会自动的减少这个细节(比如隐藏节点标签，不显示node边界0.若override(手动操作？无视？)这个策略，可以点击view-show graphics details
2.可视化地图和节点-边属性浏览会打开很多可视化选择，比如把标签大小和富集得分或p-values进行连接。这可以参考cytoscape手册
3.如果你使用的是GSEAs MSigDb,那么你可以为每个基因集获取额外的信息，方法是添加一个额外的属性（edit-preferences-properties-add-enter proterty name:nodelinkouturl.MSigDb-enter property value:http://www.broad.mit.edu/gsea/msigdb/cards/%ID%.html-make current cytoscape properties default-OK*现在你可以在一个node上右击选择linkout/MSigDb
在浏览器打开这个node代表的基因集。
4.当家长GSEA结果时，无序定义每个file。使用GSEA RPT文件就自动包含了EM界面所有的file。（具体在下面5的下面）
5.你可以在一开始定义更为宽松的p-value，q-value和系数阈值，也可以在网络产生之后来调整他们，这个操作在结果面板的右边。
RPT files
1.GSEA结果的一个特殊的trick，在任何的GSEA分析中，会产生一个rpt文件，这个文件定义了所有文件的位置（包括gmt，gct，result文件，phenotype specification，rank files）
2.dataset tab（expression，enrichment results1 or enrichment result 2）下的任何fields都可以识别rpt文件，并且populate（进入）GMT,Expression，enrichment results1，enrichment results2，phenotypes，和ranks the values）。
3.第二个rpt文件可以从dataset2加载。如果定义的GMT文件和dataset1的文件不同，会产生一个警告，你可以选择使用dataset1的GMT，dataset2的GMT，或放弃第二个rpt的加载。
4.rpt文件是一个text文件，有下面的信息（用”’’”围绕的参数是EM使用的）。
EDB files(GSEAfile****类型)
GSEA结果文件夹中有一个edb文件夹。里面有下面几个文件
1.result.edb
2.gene-sets.gmt
3.classfile.cls(只在GSEA分析，不在GSEAPreranked分析)
4.rankfile.rnk
5.如果在dataset tab（expression，enrichmentent results1或enrichment results2）定义了results.edb文件，那么gmt和enrichment 文件区域会自动加载。
6.if你想把表达谱文件加到分析中，那得需要手动加载。
高级设置-****额外文件
每个dataset，用户还可以设置额外的参数文件（但不是必须的）
这些高级参数包括
1.ranks files 定义分析中基因的ranks
这个文件有固定的格式，上面也说过了。Gene tab rank（得分）。RNK文件是GSEA文件类型。和GCT,TXT文件完全不同。它只有包含基因名字和rank（或得分）。第一行包含列文件名（比如，gene name（-tab）rank name
RANK文件的每一行包含name（--tab--）rank (or score)
参数
Node参数
1.node筛选出现在EM中的基因集
2.若在EM中出现，那么基因集许通过p-value和q-value阈值
p-value
所有小于p-value阈值的基因集都会在EM中出现
FDR Q-VALUE
所有在限定的q-value阈值之下的基因集都会在EM中出现。
根据分析类型，FDR Q-value用于EM过滤基因集的标准不一样
GSEA:使用的是gsea-result文件的第八列，名为FDR q-value
Generic：generic结果文件的第四列
David：davide结果文件的低12列，名为“Benjamini“
Bingo：Bingo结果文件的第三列，名为“core p-value”
Edge参数(gene集关系)
1.一个边代表存在的两个基因集A和B的基因重叠程度
2.edge定义EM中边的数目Edge specific parameters control the number of edges that are created in the enrichment map
3.过滤边只能选择一种系数type(coefficient type)
参数选择的tips
P-value和FDR阈值
GSEA可以使用两种不同的显著性评估：基因集permutation和phenotype permutation。Gene-set permutation用于GM应用例子
Gene-set permutation
下面是你可以考虑的gene-set permutation的不同设置阈值
Very permissive（p-value<0.05,FDR<0.25）
Moderately permissive(p-value<0.01,FDR<0.1)
Moderately conservative(p-value<0.075,FDR<0.075)
Conservative(p-value<0.001,FDR<0.05)
为了获取更高的质量，高覆盖范围的转录组数据，以非常保守的阈值进行富集的基因集数目通常在100-250之间，（使用gene-set permutation）
phenotype permutation
推荐 p-value<0.05,FDR<0.25
总体，只有你很难发现富集的基因集，我们才推荐使用permissive 阈值。
Jaccard vs Overlap coefficient
1.选择overlap系数：发生重叠的基因集发生在large size和small size之间，比如GO条目
2.选择Jaccard系数：和上面相反，比如两个基因集含的基因数差不多
3. When the gene-sets are about the same size, Jaccard is about the half of the Overlap Coefficient for gene-set pairs with a small intersection, whereas it is about the same as the Overlap Coefficient for gene-sets with large intersections.
4.特殊情况，当使用OC时，如果产生的map有几个大的基因集过分的和很多其他基因集发生连接，这是可以转向JC
Overlap阈值
大多数的分析推荐使用0.5，一个相对moderately conservative阈值
0.3更加permissive，可能会导致一个混乱的map
Jaccard阈值
0.5非常保守
0.25moderately 保守
界面
输入面板
1.分析类型Analysis Type
GSEA:接受GSEA的结果文件。文件格式对GSEA的文件十分友好。这个类型和generic的最大区别是富集结果文件的数目和格式。GSEA分析总是有2个富集结果文件，分别是两个相比较的表型文件对应的结果文件，也就是一个表型文件一个。
Generic：接受和GSEA分析结果一样的文件格式，就是富集结果文件不一样。并且，它就一个富集文件。Enrichment Map User guid
DAVID:没有gmt或表达谱文件，接受DAVIDE来的富集文件
2.基因集
描述基因集的gmt格式文件。用户可以通过硬盘上的文件加载
3.Dataset1：用户可以指定表达谱或富集文件，或者一个rpt文件，这个rpt文件可以加载所有的genesets，dataset1，2，和高级部分。
4.Advanced：初始状态是隐藏的，这可以通过点击右边的小箭头展开。用户可以修饰表型标签或加载基因rank文件
5.参数：用户可以指定p-value，FDR和OC或JC值。
6Actions：user有三种选择，reset（清除所有输入），close（关闭输入面板），build enrichment map（执行）
Data面板(位于底部)
有2中不同的展示窗口，每一个都是单独的数据面板。EM overlap和EM gene set。这两种表达方式的差异仅仅是基因列表的差异。
1.EM overlap expression viewer显示所有算则的基因集之间的重叠基因的表达（交集）
2.EM geneset expression viewer显示选择的基因集的所有合并的基因表达情况（并集）
3.标准化
Data as is-代表载入的数据
Row Normalize Data-每一行的表达值的平均值跟随SD
Log Transform Data-每个表达值的log值
4.sorting
Hierarchical cluster-根据整个表达set的皮尔逊相关系数计算
如果rank文件被提供，会显示Dataset 1ranking和dataset 2 ranking，通过选择，用户可以相应的对表达谱排序
如果表达值没有相应的rank，那么热途中不会出现表达值
Add ranking运行用户上传额外的rank文件（格式要正确）对rank文件的大小没有限制。但用户需要对rank文件提供一个名字。
5.save expression set
在展示的窗口，用户可以保存表达值成txt文件（当前展示的）*
6.输出表达set(PDF)
用户可以储存当前展示的表达热图成pdf文件。不幸的是这个PDF文件不完美。列的名字在底部而不是在上部。这个问题希望在以后的cytoscape版本解决。
results面板(位于右边)
参数pane
用户可以通过滑动块调整p值和q值
1.phenotype1
2phenotype2
3.p-value cutoff向左移降低p****值，会导致网络中node和相应的边减少；向右移会重新建立新node和相应的边。注意的是，建立网络的时候定义的p值不能增加。
4.Q-value cutoff向左移，降低q值，导致node和相应边在网络中移除；向右移重建。同p值，不能大于建网时的q值。
5.相似性cutoff向右移，增加阈值，导致边被移除，向左移，重建新边。不能小于建网时定义的值。
6.在浏览器加载GSEA结果
7.建立EM时的参数列表
8.热图自动聚焦默认是选中的。当你选中网络中的任何node和edge，EM自动更新表达视图。
9.default sorting order在表达视图gene可以根据等级聚类，rank，columns进行sort或不sort。
10.default distance metric对于等级聚类有三种可选择的distance metrics来计算基因之间的距离。默认是皮尔逊相关系数。如果你想使用其他的方法，重新选择就可以。