VCF格式

刘小泽写于18.7.17
所有的数据，一旦要找变异位点信息，就离不开VCF。豆豆也是在写一个重测序的操作流程，遇到了VCF文本，之前也是没有了解过，这次再多学一个格式官方最新说明文档https://samtools.github.io/hts-specs/VCFv4.3.pdf这个文件格式的解读会比以往各种文件都要重要，有了它就能直接进行分析了，属于离下游可视化最近的数据

VCF是什么？

这个东东的全名是：Variant Call Format【真的是“简称让我无地自容，全称使我无师自通啊”】它是存储变异位点的标准格式，可以用来表示单核苷酸多态性（SNP）【在人类基因组中，分布普遍并且密度比较大，总数超过10⁷，平均每300bp就有一个SNP 】、插入缺失（InDel，也就是短片段的插入与缺失）、结构变异(SV: Structural Variant，也就是大片段的插入与缺失) 、拷贝数量变异（CNV：Copy Number Variant）【说一下CNV：比如一个基因在染色体的一条染色单体上的数目为1，但是在染色体复制过程中，不知为何，复制结束后该基因在染色单体数目由1变成了2或者n。尤其在人类基因组中存在大量大于1 kb但小于3 Mb的DNA片段多态。它发生的频率远远高于染色体结构变异，并且整个基因组中覆盖的核苷酸总数大大超过SNP的总数】

变异的生物学基础

遗传与变异：遗传就是将亲代的遗传物质传递给子代，这样保持了世代交替中的稳定性；但是，这种稳定性又非一成不变，每个个体的基因组随着时间和空间的变化，导致结构发生改变，从而产生了不同于亲本的性状，这就是变异。总而言之，遗传保持了物种代代之间可持续性，变异提供了长期进化过程中的适应性，又促进了进化。

同一个亲本的子代在不同时间、不同空间与环境相互作用，就会出现不同的基因型和表型，基因检测就是通过检测不同样本基因组上的差异，来推断基因型与表型之间的关系，还有与环境之间的互作关系。

基因组上的变异主要有单个碱基的变异（转换、颠换、插入、缺失）以及染色体水平的变异（插入、缺失、易位、倒位）。这些表现在基因组检测上就是：SNP、InDel、SV、Corpangene（插入缺失发生在基因水平）、CNV（发生在串联重复区的插入与缺失）

变异物质基础：

基因组发生变异的原因主要可以分为自发突变和诱发突变。之所以能够累计这么多突变，主要由于自发突变。而引起自发突变的原因也有很多，比如DNA复制过程中由于DNA聚合酶产生错误、DNA物理损伤、转座等，但这些错误和损伤大多会被自身的修复系统修复，那么为什么还会有这么多变异位点存在呢？

这是因为～

碱基能够以互变异构体的不同形式存在【A-T配对变为GC的过程】

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InDel：碱基有时会从核苷酸移除，留下一个叫做脱嘌呤或者脱嘧啶的缺口，进行下一轮复制时不能够正常配对。【原因可能是胞嘧啶自然脱氨基形成尿嘧啶，因为尿嘧啶并非DNA的碱基所以被DNA自身的修复系统识别并清除，留下一个空位】

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转座子：随机插入到基因组，就相当于基因组上一个位点被复制/剪切后粘贴。当有多个这种序列结构时，他们之间就是同源的，因此就会导致同源重组【同源重组：非姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，进而引起缺失、重复、倒位等】

VCF文件怎么用？

VCF使用UTF-8编码，有两大部分：一部分是注释信息（以##开头），一部分是具体突变信息【给出两个例子】

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注释信息（##表示）

十分重要！后面每一个位点的描述的tag都在这个注释信息里面可以找到

INFO是碱基位点的注释，对应红框中的INFO，是对基因组特定位置进行的计算；FORMAT是每个样本都有的描述

第一行：一定是##fileformat ，VCF格式版本号
##FILTER：显示这个文件已经进行了过滤
然后是使用软件的名称及参数
##reference & contig：使用的参考基因组信息及参考基因组contig信息
##INFO行：每一行必须的四个标签是：ID、Number、Type、Description主要有几个tag标记：AD、DP、GQ、GT、PL

具体信息

红框位置就是数据文件的头信息（#表示），主要有CHROM、POS、ID、REF、ALT、QUAL、FILTER、INFO、FORAMT、SAMPLE【前8列必须要有】

CHROM：变异位点从参考序列哪个染色体区段上找出来的
POS：异位点相对于参考基因组所在的最左端位置（属于1-坐标系统：从1开始计数）【如果是InDel的情况，那么这个数值对应InDel的第一个碱基位置】

1-based coordinate system ：序列的第一个碱基设为数字1，如SAM,VCF,GFF,wiggle格式0-based coordinate system ：序列的第一个碱基设为数字0，如BAM, BCFv2, BED, PSL格式
ID：变异位点名称（对应dbSNP数据库中的ID；若没有，则默认用. 表示他是一个novel variant）
REF：参考序列该位置碱基类型及个数
ALT：该位置变异的碱基类型及个数【多个用逗号分隔；对于SNP是单个碱基的改变；对于InDel是碱基数量的改变】
QUAL：变异位点质量值（与测序数据一样也是用Phred格式表示）Phred值= -10 * log(1-P), P是变异位点存在的概率。值越大，此位点保持原状的概率越低，越可能发生变异。但是这个值随着数据量增大而变大，并非十分准确
FILTER：下一个位点是否要被过滤掉，如果显示PASS，说明下一个位点和参考序列一致，那么这个位点有更大可能性为变异位点
INFO：结合描述理解有关该位点的额外信息 【包含信息最多，形式为Tag=Value, 分号分隔】
FORMAT：变异位点格式
SMAPLE：使用的样本名称，由bam文件中@RG的SM标签决定

关于第八列INFO

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看上去是一列，但其中的内容可以无限扩增，常用的tag主要有：

AC、AF、AN【和等位基因有关】： AC：Allele Count该位点变异的等位基因数目； AF：Allel Frequency 等位基因频率； AN：Allel Number 等位基因的总数目

【单看这个不好理解，举一个二倍体diploid例子：基因型0/1表示为杂合子，该位点只有一个等位基因发生突变，AF=0.5（在该位点只有50%的等位基因发生突变），总的等位基因数目为2；基因型1/1表示为纯合子，AC=2，AF=1，AN=2】

DP：一部分reads被过滤掉后的覆盖度

DP4 ：高质量测序碱基，在ref或alt前后

Dels：官方解释是“Fraction of reads containing spanning delections”，这个值用来区分indel和snv【SNV与SNP？--一个物种中该单碱基变异的频率达到一定水平就叫SNP,而频率未知（比如仅仅在一个个体中发现）就叫SNV】【有这个tag且为0时表示该位点是SNV，没有就是InDel，可以用来区分二者】

其他Tag：

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还可以参考：http://www.bio-info-trainee.com/863.html

关于第九列FORMAT

表头的##FORMAT就是对第九列的解释，主要包括某一个特定位点基因型、测序深度的表述

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主要包含两列：前列为格式，后列为对应的数据【他们之间都用冒号隔开】

GT：样本基因型（genotype），两个数字之间【这里是1/1】斜线分隔，表示二倍体样本的基因型。0代表样本中ref的allel，1代表样本variant的allel，2表示有第二个variant的allel。0/0表示样本中该位点纯合，与ref一致；0/1表示样本中该位点杂合，有ref和variant两个基因型；1/1表示样本中位点纯合，与variant一致

AD和DP： 【第八列也有DP，但含义不同】AD是Allele Depth，样本中每一种allel的reads覆盖度，在二倍体中是用逗号分隔的两个数，前面对应ref，后面对应variant；DP是Depth，是样本中该位点覆盖度

PL: Provides the likelihoods of the given genotypes指定三种基因型的质量值大小(基因型为0/0, 0/1, 1/1)，对应的值越大，表示这种基因型的可能性越小