RNA-seq中的那些统计学问题（一）为什么是负二项分布？

1. 转录组数据统计推断的难题

在RNA-seq中进行两组间的差异分析是最正常不过的了。

我们在其它实验中同样会遇到类似的分析，通常，我们可以用方差分析判定两组“分布”数据间是否存在显著差异。原理是：当组间方差大于组内方差（误差效应），并且统计学显著时，则认为组间处理是可以引起差异的。

有伙伴肯定要问，转录组数据到底有什么了不起的？它们为什么不能用我们熟悉的算法简单地进行计算？

其实统计学家也很无奈啊，看看我们转录组实验得到的这些数据吧：我们的实验只进行少得可怜的生物学重复（n<10），而且，任何基因的表达量都不能是负数，这些数据并不符合正态分布，用于表征表达量的counts是非连续的（芯片信号是连续的），RNA-seq数据的离散通常是高度扭曲的，方差往往会大于均值……，就这些奇怪的特征，使得准确估计方差并没有想象的那么容易。

我们面临两个核心问题：

基因表达数据适合用什么统计学分布进行差异显著性检验？
如何利用少量生物学重复数据估算基因表达的标准差？

2. 泊松分布 or 负二项分布？

从统计学的角度出发，进行差异分析肯定会需要假设检验，通常对于分布已知的数据，运用参数检验结果的假阳性率会更低。转录组数据中，raw count值符合什么样的分布呢？

count值本质是reads的数目，是一个非零整数，而且是离散的，其分布肯定也是离散型分布。对于转录组数据，学术界常用的分布包括泊松分布 (poisson)和负二项分布 (negative binomial)两种。

2.1. 为什么泊松分布不行？

首先有必要简单地介绍一下泊松分布

泊松分布适合于描述单位时间（或空间）内随机事件发生的次数（事件发生的次数只能是离散的整数）。如某一服务设施在一定时间内到达的人数，电话交换机接到呼叫的次数，汽车站台的候客人数，机器出现的故障数，自然灾害发生的次数，一块产品上的缺陷数，显微镜下单位分区内的细菌分布数等等。

泊松分布大概长这样：

λ是波松分布所依赖的唯一参数。 λ值愈小分布愈偏倚，随着λ的增大，分布趋于对称。当λ=20时分布接近于正态分布；当λ=50时，可以认为波松分布呈正态分布。

在数据分析的早期，确实有学者采用泊松分布进行差异分析，但是发展到现在，几乎全部都是基于负二项分布了，究竟是什么因素导致了这种现象呢？为了解释这个问题，我们必须提到一个概念 overdispersion。

dispersion指的是离散程度，研究一个数据分布的离散程度，我们常用方差这个指标。对于泊松分布而言，其均值和方差是相等的，但是我们的数据确不符合这样的规律。通过计算所有基因的均值和方差，可以绘制如下的图片：

横坐标为基因在所有样本中的均值，纵坐标为基因在所有样本中的方差，直线的斜率为1，代表泊松分布的均值和方差的分布。可以看到，真实数据的分布是偏离了泊松分布的，方差明显比均值要大。

如果假定总体分布为泊松分布，根据我们的定量数据是无法估计出一个合理的参数，能够符合上图中所示分布的，这样的现象就称之为overdispersion。

由于真实数据与泊松分布之间的overdispersion，选择泊松分布分布作为总体的分布是不合理。

以上只证明了泊松分布是个不太恰当的分布估计，那怎么证明负二项分布就是合适的分布估计呢？

2.2. 为什么负二项分布行？

主要是从均值与方差之间的关系去证明

同样的，也先简单介绍一下负二项分布：

二项分布描述的是n重伯努利实验，在n重贝努利试验中，事件A恰好发生x(0≤x≤n)次的概率为：

它的概率分布图如下：

负二项分布描述的也是伯努利实验，不过它的目标事件变成了：对于Bernoulli过程，我们设定，当某个结果出现固定次数的时候，整个过程的数量，比如我们生产某个零件，假设每个零件的合格与否都是相互独立的，且分布相同，那么当我们生产出了五个不合格零件时，一共生产了多少合格的零件，这个数量就是一个负二项分布，公式如下：

该公式描述的是，在合格率为p的一堆产品中，进行连续有放回的抽样，当抽到r个次品时，停止抽样，此时抽到的正品正好为k个的概率

它的概率分布如下：

p=0.5, r=5