single cell~ single cell~ single all the way~

刘小泽写于19.5.16
分析单细胞数据，尤其是10X需要对barcode、UMI、拆分等名词进行了解，于是追根溯源，发现理解它的工作原理对后续分析的进行会有帮助

先看个图片，有个大体印象

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图1

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图2

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图3

10X 机器做了什么？

10X公司把微珠加DNA标签、微滴反应、酶反应以及高通量测序后的数据分析整合到了一起，做了一个基于油包水乳浊液酶反应原理的分析系统。

看到的10X机器就是制备油包水的乳浊液，它搭配芯片一起工作，这个机器制备一次乳浊液大约耗时7-9分钟，能产生500-8万个细胞

再看看芯片(上图二)，芯片有4排8列，也就是32个孔。每一列孔对应一个样本，也就是说，一张芯片一次可以处理8个样本。
（图二）中
编号1️⃣的孔是用来放样本的(sample well)；
编号2️⃣是用来放预制微珠（gel beads）；
编号3️⃣是用来放油的，最上面那一排是做好乳浊液以后，回收乳浊液的孔

目前单细胞测序主要还是基于对一群细胞中每个细胞的表达量分析

工作原理第一步：微珠上DNA引物设计

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图4

先预制凝胶微珠，也就是所说的gel beads，然后每个凝胶微珠"种上"特定的DNA片段，每个DNA序列分成几段：

第一段是barcode，16bp碱基，大约350万种barcodes，一个微珠对应一个barcode，利用这么多barcode可以区分各个凝胶微珠。=》每个凝胶微珠的ID号

其中任意两个barcode之间至少差两个或者两个以上的碱基，因为测序存在对碱基的误读，这样设计可以避免将两个barcode搞混(可以试想，如果两个barcode之差一个碱基，那么就有16分之一的概率将两个判断成一个)
第二段是UMI序列，即unique molecular index，它是一段随机序列，也就是说每个DNA分子都有自己的UMI序列，UMI长为10bp，那么就有4^10=1,048,576也就是100多万种变化。它的作用就是经过了PCR+深度测序后，找到reads与原始cDNA的对应关系 =》每个DNA标签分子的ID号

它考虑到了这样一种情况：一个基因片段经过PCR扩增产生多个reads，但是不加标记我们是不知道的，并且不同基因的PCR扩增效率可能不同，因此一个基因最后得到的reads数就可能由于PCR扩增效率高而超过了另一个基因(而这两个基因的真实表达量可能差不多)。也就是排除"PCR bias"
第三段是Poly(dT)序列，它起到的作用是与mRNA的poly(A)尾巴结合，作为逆转录的引物，将cDNA逆转录出来

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图5

工作原理第二步：芯片的液流管路

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图6

细胞混悬液在第一个十字交叉口，与凝胶微珠混合；接着进入第二个交叉口，这时加上油滴，把凝胶微珠+细胞混悬液包裹起来=》油包水的小液滴=》这些油包水的小微滴就组成了乳浊液

乳浊液中，有的是包含一个细胞的(红圈部分)，也有的不包含细胞，还有的有两个以上细胞(这个叫"Doublets") ，一个小液滴中包含几个细胞是符合"泊松分布"的。

大部分细胞会匹配到一个小液滴中(细胞混悬液中大约有65%的细胞可以被成功包到有微珠的小液滴中=》也叫做细胞的捕获效率~65%)，后续分析的reads就是从它们这里来的

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图7

工作原理第三步：测序文库构建

得到乳浊液后，就要脱掉细胞膜，让其中的mRNA游离出来=》

游离出来的mRNA与小液滴中的水相混合，水相中包括凝胶微珠上连着的核酸引物、逆转录酶、dNTP底物，发生逆转录反应=》

通过mRNA的polyA与凝胶微珠上的polyT互补，mRNA与凝胶微珠上带有标签的DNA分子结合起来，然后在逆转录酶作用下，逆转录出cDNA=》

这样得到的cDNA分子是带有微珠特定的barcode标签的，并且每个cDNA分子带有特定的UMI标签，有了这两个标签，就可以区分这个特定的cDNA与其他的cDNA=》

然后将乳浊液中所有的水相抽出来，也就是把带有标签的cDNA分子抽出来=》

cDNA分子加接头，PCR扩增，得到illumina文库

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图8

数据构成

一个样本一般就测几百或几千细胞，barcode种类却有3百多万，所以很少出现一个barcode对应两个细胞的情况。因此得到的数据可以通过barcode拆分，将测序reads回溯到每个细胞

当然，是有可能出现一个barcode对应两个甚至多个细胞的情况，这时如果按照barcode去拆分，就会将这两个或者多个细胞的reads组合成一个"pool"。因此，为了减少pool的出现，就要在细胞混悬液制备阶段，控制原始的细胞数量

所以这里看到，并不是制备的细胞数越多越好。原始细胞数越少，最后的混合pool就越少，这也是符合泊松分布的。一般来说一个样本混悬液的细胞数在1万以下比较好

利用UMI对reads进行简并，就可以看到细胞reads与基因数量之间的关系，比如这样：横坐标是细胞reads数，纵坐标是基因数，reads数越多能得到的基因也就越多。一般来说一个细胞读到30万条reads后，基因数量随reads数增加的速度会变慢=》基因数量"平台期"

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图9

一般一个细胞可以得到4万-8万个有效的UMI，平均一个细胞的一个基因有10个UMI；

一个细胞的一个基因的表达量是衡量这个细胞的一个维度，于是几千个被测基因的表达量形成了几千个维度。如果将成千上万个细胞放在一起分析，经过降维、聚类，放到一个三维空间并加上颜色，就形成了这样的分布形式

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图10

然后如果将三维空间的一团细胞拿出来，放大，继续细分，就能得到这团细胞的亚型

图11

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